Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 5

1п аП сааеа, ЕЬе аупйеяа апс! асбчКу оу роя6че ге8и!а!оту К)ч)А апс1 ргогетп шо!еси!еа аге пюби!а!ес) Ъу апс61агу тгаш-ас6п8 ргойкь тнЬоае сопсептгатюп ь геаропяче то р!аыпЫ сору пшпЪег ог то а1тегатюп5 ш !Ье рЬу5!0108у оу йе Ьоя Ъас!епшп. Р!аяпнЬ УУЬоае роы6че те801аготу тпо1еси1е Ь ап К!УА тпо1еси1е ВепегаПу Ьаче 168Ь сору пшпЬел апт! до по! ге!рите апу р!аашЫ-епсос)ес) рго!е!па 1от тер1кабоп. 1патеас1, !Ьеу ге1у епбге!у оп!оп8-Пчес1 епхушеа апс( ртосетп5 аиррПе6 Ъу йе Ьоат, !пс!ис(!08 сЬарегопеа, РХА ро1ушегаае5 1 апс1 111, РМА-с)ерепс(опт КХА ро1утпегаае, пЬопис!еаае Н (К)9аае Н), Р)У)А Вугаае, апс1 юроЬотпегаае 1 (Гог ген)етн, р!еаае аее НеПпа)6 ет а1. 1996) . ТЬеае р!аяпЫ5, тнЬ(сЬ ате ааЫ то гер!кате ш а "ге!ахесГ' Га5Ьюп, сопбпие то с)ирПса!е тнЬеп рготеш аупйея5 Ь !пЬ!Ь(тес( Ьу апипо асЫ 51атна6оп (Вахага! апс( Не! ша)с! 1968) от Ьу асЫебоп оГ ап ап6Ьюбс якЬ аа с)пгашрЬепко! (С!етнеП апс1 НеПп5Ы 1969) (р1еаае аее йе !п1оппатюп рапе! оп СНЕОВАМРНЕМСОЕ).

Весаиае рготе)п аупйея5 ь тес!шгес! Гог ш66а6оп оу еасЬ топит( оГЬоа! РЫА ауптЬеяа Ьш по! Гог р!аяпЫ гер!ка6оп, йе сопсепс оГ р!аяпЫ РЬ)А тп сеП5 ехроаес1 со с)ПогашрЬешсо! (псгеаае5 ге1агтче Со !Ье атпоипт оу сЬгошоаоша1 РЬ)А (С1еччеП 1972). Очег йе соигае оГ аечега! Ьоша оу атпр66сатюп, !ЬоиаапсЬ оу сортеа оГ а ге)ахес1 р!аяпЫ шау ассшпи!аге ш ЕЬе сеП; ат йе еп6 оу йе ргосеыЬ р1аяпЫ РХА тпау ассоипт Гог 50% ог пюге ОГ 1Ье тота1 сеПи1аг РХА. Ву сои!тая, р1аашнЬ аисЬ аа р5С101 тес!шге оп8отп8 ауптЬеяа оГ йе КерА ртоте!п Гот гер1ка6оп, апс1 йе(г сору пипаЬег саппо! Ье ашр66ед, пот 1Ье!г у!е!д тпсгеааес1, Ьу ш)ПЪттш8 сеПи1аг рготеш аушЬея5. 5исЬ р1аяпнЬ аге ааЫ то тер!кате ипс)ег "5тпп8епт" соптго1.

!.6 СЬаргег 1: Р!а|тсгЕ| апгЕ ТЬе)г Е)геЕц!пея гп Мо!еси!аг С!отп8 ег! -150 пис!еосЫеа с)оччпасгеаш. ТЬе 5' епгс оЕ |Ье -750-пис1еосЫе рНшагу сгапасНрс Ео1Па шсо а сошр1ех зесопдагу аспксцге |Ьас Ьг!п8а а СсНсЬ 1оор !и К!чАП !п|о аВ8шпепс чч!|Ь а СНсЬ хсгессЬ оЕ р1аяиЫ РХА!осасес1 20 пис1еосЫеа ирасгеаш оЕ |Ье ос!8!п оп |Ье сешр!асе асгапс1. ТЬе КХАП сгапасНрс Ь |Ьеп ргосеааегс шсо шасиге ргнпег Ьу Крахе Н, ччЬкЬ с1еачеа СЬе ВАРМА чч)сЬ)п а аег!пенсе оЕ Вче А геаЫиеа ас |Ье ог!8!п. ТЬе ге|ш1Пп8 555-пис1еосЫе |пасиге КЬ)АП 1а цаег! аа а ргниег Ьу Р!чА ро1ушегаае 1 со |пйасе зупсЬеяа оЕ йе )еагВп8 асгапс1 (Еог геч!есча апс) геЕегепсея р1еахе аее КПеа апд 5саЫ 1989; Сезагеп! ес а1.

1991; Не!ша)с| ес а1. 1996). Ехсепыоп оЕ сЬе асаЫе РХА-КЫА ЬуЪгЫ ехроаеа ясех оп |Ье согпр!еи|епсагу асгапг) оЕ РХА ас чгЫсЬ йасопсшцоиа ауп|Ьеяа оЕ йе!а88!п8 асгапс)1а шК|асег!. Веса|ье )а88)п8-асгапсс аупсЬеяа Ь Ыос)се|с -20 пис1еосЫеа ирасгеаш оЕ йе ос!8!и Ьу йе ипЬуЪгсйаегс ае8шепса оЕ КЬ)АП, гер1|- саСюп рго8геахеа ипЫ|гесСюпа1!у ш Са!гпа ог 0 аггисгигез |п р!аашкЬ саггуш8 рМВ1!со1Е! герВсопы К!к!А! 18 ТЬе сору пцтЬег ос сЬе рС)С саги|)у ос р)аагпк)а Ь пвсЬ ЫВЬег |Ьап сЬас о! осЬег р1ачгпк)а саггу|п8 а рМВ| ог со)Ес гер))соп. ТЬ)а ь Ьесацъе рС)С р)аатк)а саггу а ро)пс п|цсаВоп йас а1сега йе аесопг)агу асгцссцге ос ! СЬе роы)С)че ге8 |1а|о|у гпо)есц)е (ВЬ)АП) )п а Сешрегасцгег)ерепс)епг Еа|Ьюп. АС 3TС ог 42"С, ВИАН арреага ~ со ЕоЫ |пса а сопсоггпасюп |Ьас 'ь геы)яапс со )пЫЬ|6оп Ьу КЬ) Ч.

!п)с)ас)оп ос РЬ)А аупИ|еаь Ь епЬапсес), геац1с)п8 |п аЬпоггпа8у Ь)8Ь сору пцгпЬег. ЪЧЬеп йе Ьассепа) сц!сиге В 8гоччп ас 30"С, йе сору пцп|Ьег ос,, рс)С р!амп!г)а )а ге|сиге|) со поггпа! 1Пп-СЬао ес а1. 1992). ТЬе ягпр1ея Ьуро|Ьеа!а со ехр1а|п йе шашсепапсе оЕ р!аыпЫ сору пшпЬег 1| сЬас |Ье асеаг!у-асасе сопсепсгасюп оЕ сусор1аыпк К!чА! ь десегш!пег! Ъу Вене гсоаа8е ЕТоинха|ча 1987; СЬ|ап8 апг! Вгешег 1991). ТЬия !Е йе сору пшпЬег оЕ |Ье р1аыпЫ !псгеааеа аЬоче погша1, сЬе сопсепсгасюп оЕ КХА! чч!11 Пас апг! р!аяпЫ РХА гер1каПоп чч111 Ье шЬ|Ъ|сед. Ночгечег, йь соир!ш8 Ьесгчееп р!аяпЫ сору пшпЬег ап|1 йиссиаПопа ш |пЬ|Ь)сог сопсепсгаПоп сап |чог)с оп1у !Е |Ье Ьа1Е-1!Ее оЕ КЫА1 ь аЬогс (Рг)ссЬагг) 1984) апс! 1Е йе гасе оЕ Йе8гаг)асюп оЕ КЬ)А! ь ргорогиопа! со |Ье гасе оЕ Вго|чй оЕ |Ье си!сиге. ТЬеае ссчо сопйс!опа ЬосЬ арреаг со Ье Ец1Е|1!ед а )Че~аЕсче Кери!аЕог оЕ Кер!!СаЕ!оп ТЬе со1Е1 гер!коп ь ипаЫе со 1пс)пенсе йе ассгч!су оЕ |Ье Ьоя епхушеа гег!шге|1 Сог р!аыпЫ гер!касюп апй сЬегеЕоге, ь цпаЫе со а!сег |Ье ареегс ог соцгае оЕ ечепь сЬас оссцг аЕсег РХА аупсЬеа!а Ьаа Ьееп !п!с)асей Сопаег)цепс!у, сопсго1 оЕ сору пшпЪег шцас Ъе ехегсег) ас ог ЬеЕоге |шиаПоп оЕ РХА гер!каПоп.

5упсЬеаса оЕ р1аяиЫ РЬ)А г)ерепгЬ оп сЬе Еогшасюп оЕ а регяы сенс РЬ)А-КХАП ЬуЬН|1 ас сЬе ог!8)п оЕ гер!каСюп. 1)пг)ег погша1 снсшпасапсея 1п!Пасюп ь сопсго!! егс Ьу а1|еНп8 сЬе ег)и!1!Ьг!цш Ьессчееп соггес|1у Ео16ег) КХАП, ъчЫсЬ сап Еогш сЬе регяасепс ЬуЬН|1, апс1 |паррюрНасе1у Ео!Пег) аспксигех оЕ КЬ)АП, |чЫсЬ саппос. 5|чау очес сЬ!а ег!ш1!ЬНшп 1Ееа сЬ!ес)у !и йе Ьап|Ь оЕ КЬ)А1, а япа!1 сгапасНрс оЕ 108 Ьазеа епсогсед Ьу йе апП|епае асгапг! оЕ сЬе ВААП Вене.

В)ч)А! Ео1й !псо а с1очег1еаЕ асгиссиге |Ьас Ъ!пгЬ со |Ье паасепс КХАП ргесиг|юг апг! |ЬегеЬу ргечепь !ь Ео1йп8 шсо сЬе аесопг)агу асгцссиге гес)ц!гег) Еог Еогшасюп оЕ йе регыасепс ЬуЬгЫ | Еасасепа ап|1 Сеаагеш 1981). ТЬе шесЬап!аш Ьу счЬ~сЬ КХА! апг) КХАП |псегасс Ьаа Ьееп |!еасНЪе|1 |и Вгеас |1еса|! Ъу Тоицха|ча апд Ь!а со1!еа8иеа (е.8., р!еаае аее Тош)хачча 1990а). ТЬе рксиге сЬас ешег8еа ь опе оЕ |1упапцс шсегасПопх Ьесччееп КХА1 апд зЬогс-! 1чег) Ео! йи8 1псегшейасеа оЕ КАЦАП. ТЬе Ео1й ш8 оЕ КХАП !а рагскц!аг1у чц1пегаЫе со шсегЕегепсе Ъу КХА! |чЬеп йе паасепс КХАП сгапасНрс ь Ьесгчееп 80 апг! 360 пис!еосЫеа 1и 1еп8сЬ. ТЬе нцПа! сои!асса оссиг Ьесъчееп асеш-!пора ш сЬе санчо КХА и|о1еси1еа ап|1!еа|1 со Еогшас!оп оЕ а ае8шепс оЕ г)оиЫе-асгап<сег! КХА сЬас !пчо!чеа йе 5' аег!цепсех оЕ КХАП апг) СЬе епПге 1еп8|Ь оЕ КЬ)А1.

ВЬ)А1 СЬегеЕоге сопгго1а р!аы шЫ сору пшпЬег Ьу асПп8 аа а пе8аПче ге8и1асог оЕ |пшасюп оЕ р!аыпЫ РХА ауп|Ьеяы 1п)гог)иссгоп П7 ипс1ег поппа! соп6)Г)опк оЕ се!1 дгоъчй, ъчЬеге ГЬе Ьа)Е-!)Ее оЕ К)ъ)А! ь 1 — 2 т)писек. Кше)к са1- си1агюпк кЬоъч гЬаг 1Ь)к репой ь киЕЕгс)епг)у кЬогс Еог гЬе гпо1еси1е со асг ак а геа1-гипе кепког оЕ р!аяпЫ сору пшпЬег ) Вгепбе) ап6 Реге1коп 1993). Е)едгадагюп оЕ КХА! РгосеесЬ !и гъчо яадек. Р)гкг, )Ье Вче 5'-гегт!па! пис!еогЫек аге геточе6 Ьу епс1опис1ео!угк с1еачаде Ъу К)ъ)аке В.

ТЬе гпшсаге6 ию1еси1е саи к6)1 Ьгпъ) го К)ъ)А!! Ьиг Ь поъч кгьсер6Ые го дедгада6оп Ьу а НЬопис1еаке ъчЬоке асггчКу ь гекропяче го дгоъчй гаге (Ып-СЬао ап6 СоЬеп! 991). ТЬгк геди!абоп ргочЫек а гпесЬашяп го гпашга)п а сопкгапг пшпЬег оЕ р1аяпиЬ енеп ъчЬеп )Ье дгоъчй гаге оЕ се!1к Ь Ег)Еи). Т)ъе фогт)/Вор РгоЕе)п Еоъроъчег5 )))е МедаЕ)че Веео)аЕогу Асбч!)у оЕ Шъ)А! ТЬе еЕЕгс)епсу оЕ Ь)п6)пд оЕ КХА) го К)ъ)А)! ь )тргоче6 Ьу а р)актЫ-епсобес1 рго1еш 1споъчп ак Кот )К)ъ)А) июс101агог) ог Кор ) гергекког оЕ рпгпег). Ву ипргоч)пд гЬе еддс)епсу оЕ ЬуЪгЫ Еогтагюи Ьеичееп К)ъ)А! апд К)ъ)А!), Когп епЬапсек )Ье педа6че геди!асогу ас6оп оЕ К)ъ)А).

Ассогб)пд)у, с)е1е6оп оЕ йе тгп/тр депе шсгеакек йе сору пшпЬег оЕ со!Е) р1акиигЬ Ъу аг )еакг гъчо огг)егк оЕ тадпПибе (Тъч)дд ап6 5Ьеггаи !980). Рог ехаигр1е, с)е)е6оп оЕ )Ье гот/тр депек гаЬек 1Ье сору пигпЬег оЕ )Ье о)д ъчаг Ьогке РВК322 Егот 15 — 20 сор)ек со гпоге йап 500 сор!ек рег Ьасгепа1 се11, ъчЬегеак !пкеггюп оЕ а кедтепс оЕ Еоге)дп Е))ь)А )псо )Ье шт/гор депе сасьек 1ейа! гипаъчау р1аяпЫ Е)ХА гер!ка6оп (бра апс) Ниапд 1989). Рот ь а Ьотос))тег о) а 63-ат)по-ас)с) ро)урердс)е епсос)ег) Ьу а депе )утд 400 пис)ео)Ыек с)оъчпкггеагп Егот )Ье со)Е1 опд)п оЕ гер))садоп !Тъч)дд апг) 5Ьеггаи 1980; ТогпЬаъча апг) 5огп 1984).

ЕасЬ киЬипа оЕ йе г))тег сопякь о) Гъчо а Ье))сек соппесгес! Ьу а кЬагр Ьепг); )Ьеге)оге, )Ье с))гпег Ь а 1)дЫ Ьипг)!е оЕ Еоиг а Ье)гсек ехЬ)Ь)дпд гъчо)оЫ кугптеггу )Ваппег ег а!. 1987). Рот Ыпс)к го РМА! алс! Р)4АП ъч))Ь к!пх)аг ай)п)г)ек )Не)тег-С)иепсЬ ег а!. 1988) апг) г)г)чек ипкъаЫе )и)естес))агек Еогпъес! Ьеичееп ГЬе Ичо сотр)епъепгагу РМАк )пъо а пюге яаЬ!е кггисилге !)асаъепа еъ а!. 1984; Тот)ганча апг) 5опь 1984; Тогпгхаъча 1990Ь).

Мок) ргоЬаЫу, еасЬ оЕ йе ичо киЬипЕЫ оЕ Роги гесодпыек кег)иепсе апс! кггисгига! е!егпепь )п Ьой Р!')А! апс) Р ЧАИ. Роги Ьюсд го а яегп оп )Ье )пгегасдпд Р)4Ак, кгаЬ)))г)пд 1Ье ")ъ)кк)пд" согпр)ех )Топъьаъча 1985) апс! )п)Г)а))пд Гоггпаъюп о) а регеесс Р)4А)-РГЧАП ЬуЬпг) )ЕдисЬг апг) Тот)ханна 1990). 1Ь)СОМРАТ)В)ИТУ ОГ РЕАЯМ! 0$ 14)Ьеп 1ъчо р1акппгЬ кЬаге е!егпепь оЕ1Ье кате гер1ка6оп гпасЬгпегу, 1Ьеу сотреге ъч)й еасЬ о)Ьег 6иппд Ьо)Ь гер1ка6оп ап6 )Ье киЬкег)иепг яер оЕ раг66опшд гпго 6аидЬ)ег се1)к.

5исЬ р)актиЬ аге ипаЫе со соех)кг ъч!)Ьоиг ке)есгюп ш Ьас)епа! си!гшек, ТЫк РЬепогпепоп ь 1споъчп ак шсогпра6Ь)!!гу ) Еог геч!еъчк, р1еаке кее 13ачьоп 1984; )4очгс)с )987). Р)аятпгЬ сапу)пд йе капъе гер!коп Ье)опд го йе кате )псотраПЫ))гу дгоир апг) аге ипаЫе го Ье гпа)пга)пег) ъчПЬ)п )Ье кагпе Ьасгег)игп. Р!акгпхЬ сапу)пд гер)гсопк ъчЬоке сотропепь аге по) )п1егсЬапдеаЫе Ье!опд го г))дегепс )псогпраг)Ы))гу дгоирк апс! сап Ье гпа)пса)пег) )п ЕЬе кагпе Ьасгегвгп. Ехагпр)ек оХ р!акгпхЬ 1Ьа) аге согпраПЫе ъч))Ь со!Е14уре р)акгп)г)к аге р1 5А, Р6К, апг) Е Р1аяпЫк саггугпд 1Ье капъе гер1коп аге ке)есге6 ас гапбот Егогп )Ье гп1гасе11и1аг роо1 Еог гер!ка6оп.

Ноъчечег, й|к боек пог диагапгее йаг гЬе сору пшиЪегк оЕ гъчо р1акписЬ ъч!11 сета)п соикгапг ги а Ьасгепа1 рори1абоп. 1.агдег р1аяпЫк, )ог ехатр1е, гес)шге тоге 6пъе го гер1касе )Ьап 6о япа1)ег р1аяинЬ апд аге аг а ке!есбъе гВкас1чапгаде )и ечегу сеВ оЕ йе Ъасгепа1 рори1а6оп. Р)аяпнЬ оЕ яии!аг яхе тау аЬо Ье шсотра6Ые Ьесаике оЕ ипЬа1апсек !и 1Ье ейк)епсу оЕ шг6а6оп геки!6пд Егот кгосЬакгк ргосегьек ъч))Ып ш6)нЫиа) Ъасгепа1 се)1к.