Кандидатская диссертация: Ингибирование транслокации антибиотиком амикумацином А и механизм устойчивости к нему.

Актуальность темы исследования. Распространение устойчивости к антибиотикам среди бактерий стало серьезнейшей проблемой на сегодняшний день [Christaki и др., 2020; Baral, Mozafari, 2020]. За длительное время использования антибиотиков многие бактерии выработали разнообразные способы борьбы с ними так, что применяемые ранее антибиотики потеряли свою эффективность. Поэтому возникла необходимость в поиске новых противомикробных агентов или обращение к тем из них, которые ранее не были использованы в клинической практике. Одним из таких антибиотиков, открытых еще в 1980-ых гг., но никогда не применявшихся для лечения инфекционных заболеваний, является амикумацин А [Itoh и др., 1981]. Он был отнесен к небольшой группе изокумариновых производных. Тогда же было показано, что амикумацин А обладает не только сильными противомикробными свойствами, но также противовоспалительными, гастропротекторными и даже противоопухолевыми свойствами [Itoh и др., 1982; Li и др., 2012]. Тем не менее долгое время об этом антибиотике ничего не было известно. Лишь в 2014 г., с возросшим интересом к антибиотикам, было показано, что ингибирующее действие амикумацина А направлено на подавление функционирования рибосомы – основной мишени для действия антибиотиков [Polikanov и др., 2014; Witzky и др., 2019]. Оказалось, что, связываясь в Е сайте бактериальной 30S субчастицы рибосомы, амикумацин А взаимодействует с ней и рибосомными лигандами способом, значительно отличающимся от тех, что используют известные антибиотики того же сайта связывания. В 2016 г., было показано, что антибиотик, связываясь с эукариотической рибосомой, мог действительно избирательно подавлять рост клеток раковых линий человека, по сравнению с теми, которые не несли патологии [Prokhorova и др., 2016]. Однако молекулярный механизм ингибирования трансляции амикумацином А как в том, так и в другом случае представлен не был. Тем не менее поиск новых антибиотиков становится малоэффективным без понимания самих механизмов резистентности. Поэтому еще одним направлением борьбы с распространением устойчивости к антибиотикам является раскрытие механизмов резистентности, которые использует бактериальная клетка. Так, и для амикумацина А были найдены мутации в гене, кодирующем элонгационный фактор EF-G, которые приводили к устойчивости против антибиотика [Lama и др., 2012; Polikanov и др., 2014]. Фактор элонгации EF-G ответственен за ускорение одного из фундаментальных процессов трансляции – транслокации. Интересно, что все найденные изменения в EF-G относятся к его домену IV, который участвует во взаимодействии с комплексом мРНК-тРНК, и любое изменение в этом участке может приводить к серьезным нарушениям процесса транслокации [Savelsbergh и др., 2000; Holtkamp и др., 2014; Liu и др., 2014; Zhang и др., 2015; Peng и др., 2019]. Возможность резистентности за счет подобных изменений в EF-G, а тем более молекулярный механизм устойчивости, ранее не были показы ни для одного антибиотика. Использование бактериальной клеткой такого необычного механизма резистентности также может указывать на достаточно сложный механизм ингибирования амикумацином А. Степень разработанности темы исследования. На сегодняшний день в литературе имеется очень мало информации об амикумацине А: немного известно о путях его биосинтеза в клетках штаммов-продуцентов, мишенях действия и возможном механизме ингибирования [Li и др., 2015; Lama и др., 2012; Gao и др., 2017; Polikanov и др., 2014; Prokhorova и др., 2016]. Представленная лишь недавно пространственная структура комплекса бактериальной рибосомы с амикумацином А показала, что антибиотик взаимодействует в Е сайте 30S субчастицы с консервативными нуклеотидами спиралей h23, h24 и h45 16S рРНК, а также с мРНК в районе стартового кодона (-1 и -2 положения нуклеотидов), но не образует контактов ни с E-, ни с Pсайтовой тРНК [Polikanov и др., 2014]. Причем такое расположение антибиотика направлено на стабилизацию мРНК в рибосоме, а не на вытеснение ее или молекул тРНК, что присуще касугамицину, эдеину и пактамицину, связывающих в том же участке рибосомы [Polikanov и др., 2014]. Аналогичное положение антибиотик занимает и в эукариотической рибосоме [Prokhorova и др., 2016]. Тем не менее представленные структуры комплексов показывают статическое положение амикумацина А и на основании этих данных можно лишь предположить механизм ингибирования трансляции антибиотиком. Проведенные немногочисленные функциональные исследования также не смогли раскрыть его механизма действия [Polikanov и др., 2014; Prokhorova и др., 2016]. Однако основываясь на этих данных, было выдвинуто предположение, что основное действие антибиотика может быть направлено на подавление этапа транслокации. Исследование мутаций в генах, приводящих к устойчивости против амикумацина А на примере Escherichia coli и Staphylococcus aureus, показало, что такие мутации могут относиться к гену 16S рРНК, метилтрансферазы KsgA и EF-G [Lama и др., 2012; Polikanov и др., 2014]. Механизмы резистентности за счет найденных нуклеотидных замен в 16S рРНК и за счет изменений аминокислотной последовательности KsgA, приводящих к нарушению ее функционирования, ранее были хорошо изучены на примере других антибиотиков, таких как пактамицин и касугамицин [Helser и др., 1972; Mankin, 1997]. Найденные же мутации в гене EFG, приводили у S. aureus к одиночным аминокислотным заменам G542V или G543S (нумерация для E. coli), а у E. coli – к аминокислотным заменам G542V, G581A или вставке дополнительного валина перед V544 (ins544V). Все эти изменения относятся к домену IV фактора EF-G и пространственно очень близко располагаются к двум функционально важным петлям I и II этого домена, которые, как считается, образуют непосредственные контакты с комплексом мРНКтРНК и сопровождают его в рибосоме при перемещении [Gao и др., 2009; Lin и др., 2015]. Тем не менее проведенные исследования показали, что любые изменения в петлях I и II, и особенно при H584, могут приводить к существенным нарушениям процесса транслокации [Savelsbergh и др., 2000; Holtkamp и др., 2014; Liu и др., 2014; Zhang и др., 2015; Peng и др., 2019]. Все это указывает на достаточно сложный механизм резистентности к антибиотику за счет найденных изменений, который только предстоит раскрыть. Однако понимание механизма ингибирования транслокации антибиотиком и механизма устойчивости к нему, который также связан с этим процессом трансляции, невозможно без понимания особенностей самой транслокации. В осуществлении транслокации принимают участие разнообразные структурные элементы рибосомы. Одним из них является А-сайтовый выступ (ASF) 50S субчастицы рибосомы. Он представляет собой петлю H38 23S рРНК, которая контактирует с молекулами тРНК при их перемещении [Yusupov и др., 2001]. Ранее были сделаны попытки определить роль ASF в транслокации: изучалось влияние ASF на перемещение комплекса мРНК-тРНК, связывание молекул тРНК в A и P сайтах, ГТФазную активность EF-G и др. [Sergiev и др., 2005; Komoda и др., 2006]. Однако вопрос о роли этого элемента рибосомы в транслокации так и остался открытым. Не менее важным вопросом является и роль самого EF-G в транслокации. Известно, что рибосома может транслоцировать комплекс мРНК-тРНК без участия фактора, присутствие EF-G приводит к значительному ускорению этого процесса (> 1000 раз) [Katunin и др., 2002]. Известно также, что EF-G является одним из самых высококонсервативных белков [Margus и др., 2007]. Возникает вопрос, будет ли изменяться транслокация, если использовать гетерологичный EF-G, например, в трансляционной системе E. coli использовать фактор из Thermus thermophilus. С одной стороны оба факторы очень схожи, но с другой, как было упомянуто выше, даже единичные аминокислотные замены могут приводить к существенному понижению скорости транслокации (> 25 раз) [Savelsbergh и др., 2000; Holtkamp и др., 2014; Peng и др., 2019]. Изучение данного вопроса является важным для понимания фундаментальных основ процесса транслокации. Цели и задачи. Целью данного исследования является определение молекулярного механизма ингибирования трансляции антибиотиком амикумацином А, а также механизма устойчивости к нему за счет изменений в домене IV фактора EF-G. Исходя из поставленной цели, задачами данного исследования являются: 1. Изучить влияние амикумацина А на основные стадии цикла элонгации: связывание аминоацил-тРНК в А сайте рибосомы (декодирование), образование пептидной связи и транслокацию. 2. Определить влияние аминокислотных замен G542V, G581A или вставки ins544V фактора EF-G на транслокацию. 3. Изучить компенсаторное влияние найденных изменений EF-G на ингибирующее действие антибиотика. 4. Провести сравнительное изучение транслокации, катализируемой элонгационным фактором EF-G из мезофильного (E. coli) и термофильного (T. thermophilus) микроорганизмов. 5. Изучить влияние структурного элемента 50S субчастицы бактериальной рибосомы Асайтового пальца (ASF) на транслокацию. Научная новизна. В нашей работе мы впервые показали молекулярный механизм ингибирования трансляции амикумацином А. Кроме того, нами был впервые представлен механизм резистентности к антибиотику за счет изменений в домене IV фактора EF-G. Еще одним результатом данной работы является доказательство того, что для процесса транслокации важны не только петли I и II домена IV, но и другие его структурные элементы, не участвующие в непосредственном контакте с комплексом мРНК-тРНК. С использованием гетерологичной трансляционной системы показано, что кинетика транслокации не зависит от температурного оптимума элонгационного фактора EF-G. Кроме того, мы также подтвердили, что укорочение ASF не влияет на перемещение комплекса мРНК-тРНК и в большей степени оказывает влияние на изменение конформации рибосомы. Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состоит в уникальности продемонстрированного механизма ингибирования трансляции амикумацином А, принципиально отличающимся от механизмов ингибирования антибиотиками того же сайта связывания на рибосоме. Кроме того, представленный механизм устойчивости к антибиотику расширяет представление о разнообразии способов резистентности, которые может применять бактериальная клетка. Полученные данные об отдельных аспектах транслокации углубляют представление об этом процессе трансляции. Практическая значимость работы состоит в возможности использования данных о механизме ингибирования и устойчивости к амикумацину А для создания фармакологических препаратов на его основе, направленных не только для борьбы с инфекционными, но и, возможно, с противоопухолевыми заболеваниями. Методология и методы исследования. Для того, чтобы установить механизмы ингибирования и резистентности к амикумацину А, мы определяли кинетические и термодинамические параметры отдельных стадий трансляции. Так как все эти стадии являются очень быстрыми (не превышают доли секунды), то в нашей работе мы использовали метод остановленного потока, который позволял нам определять престационарную кинетику этих процессов. Определение кинетики реакций осуществляли с помощью детекции флуоресценции от флуоресцентных репортеров ковалентно связанных со строго определенными участками на молекулах тРНК. Такой подход позволял нам проследить не только за изменениями в этих участках тРНК, но и в соответствующих участках на рибосоме. Кроме того, для установления кинетических параметров, нами был использован метод погашенного потока, а также функциональные тесты in vitro, такие, например, как пуромициновая реакция, стабильность связывания тРНК с рибосомой и др. Для этих методов нами были использованы радиоактивномеченые тРНК, также содержащие метку в строго определенных участках.