Автореферат диссертации "Флуоресцентные твердофазные индикаторные системы для определения нейромедиаторов и их метаболитов в биологических объектах"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук "Флуоресцентные твердофазные индикаторные системы для определения нейромедиаторов и их метаболитов в биологических объектах" - 2019 год

Актуальность работы.
Основу регуляции деятельности центральной и периферической нервной систем, а также сердечно-сосудистой системы человека составляют нейромедиаторы, участвующие в энергетическом обмене, микроциркуляции и снабжении тканей кислородом, передавая нервные импульсы от клетки к клетке. Вследствие того, что уровень нейромедиаторов и их метаболитов в организме здорового человека и пациента с патологией, связанной с нарушением нейромедиаторного обмена, различен, они являются маркерами для диагностики, в том числе ранней, ряда заболеваний. Патологические нарушения метаболизма нейромедиаторов подразделяют на два типа: нейроэндокринные (например, феохромоцитома, нейробластома, карци-ноидные опухоли, сопровождающиеся повышением уровня маркеров в организме) и нейродегенеративные (например, болезни Паркинсона и Альцгеймера, приводящие к понижению содержания маркеров в организме). К настоящему времени наиболее хорошо изучена роль в патогенезе указанных заболеваний низкомолекулярных маркеров, таких как биогенные амины – дофамин, эпинефрин, норэпинефрин, серотонин и их метаболиты. Сложность определения нейромедиаторов в плазме крови, клетках и других биологических объектах заключается в том, что их нормальные концентрации у человека крайне низки (от 10 пМ), а при некоторых нейродегенеративных нарушениях они становятся еще на порядок ниже. Кроме того, нейромедиаторы подвержены окислению кислородом и матричными компонентами биообъектов, а также быстрому разрушению, поэтому определять их необходимо быстро (в течение 15 – 30 мин после отбора пробы). Важным аспектом является возможность одновременного селективного определения нескольких аналитов в одной пробе. Современные инструментальные методы анализа не решают эту проблему комплексно: высокая чувстви-тельность и селективность метода ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием не обеспечивают нужную экспрессность из-за необходимости длительной и трудоемкой пробоподготовки образцов и продолжительного анализа, а биосенсоры, электрохимические и иммунохимические методы определения указанных аналитов не достигают нужной чувствительности и селективности. В связи с этим, актуальной задачей аналитической химии является разработка новых чувствительных, селективных и экспрессных методик определения нейромедиаторов и их метаболитов в биологических жидкостях и клетках с целью диагностики нарушения их метаболизма.
Цель работы – создание флуоресцентных твердофазных индикаторных систем для чувствительного, селективного, экспрессного, в ряде случаев мультиплексного, определения низкомолекулярных нейромедиаторов и их метаболитов, основанных на образовании ими флуоресцирующих продуктов реакций дериватизации и комплексо-образования, в биологических объектах.
Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

• получить интенсивно флуоресцирующие производные и комплексы нейромедиаторов и их метаболитов по реакциям дериватизации продуктов их ферментативного окисления с ароматическими аминами и образования комплексов с европием(III) и окситетрациклином;
• разработать методики иммобилизации комплекса {Eu³⁺–ОТЦ} в пленках и гидрогелях биосовместимых природных полимеров в ячейках полистирольного микропланшета с целью стабилизации компонентов индикаторной системы и повышения чувстви-тельности и воспроизводимости результатов анализа;
• разработать флуоресцентные методики мультиплексного, высокочувствительного, селективного и экспрессного опреде-ления нейромедиаторов и их метаболитов в биологических объектах на уровне их референсных концентраций в организме здорового человека и ниже с использованием предложенных индикаторных систем.

Научная новизна работы

• Предложен комплексный подход к чувствительному, селективному, экспрессному и мультиплексному определению нейромедиаторов и их метаболитов, основанный на направленном варьировании природы дериватизирующего агента (ароматического амина) при получении интенсивно флуоресцирующих производных аналитов в присутствии пероксидазы, иммобилизованной в пленке хитозана в микропланшете, спектральных характеристик возбуждающего и испускаемого излучения, а также на применении производной флуоресцентной спектроскопии 1-го порядка.
• Разработана новая твердофазная индикаторная система, основанная на образовании интенсивно флуоресцирующих комплексов нейромедиаторов и их метаболитов с европием(III) и окситетра-циклином, иммобилизованных в пленках и гидрогелях биополи-меров; система положена в основу флуоресцентного высокочувстви-тельного, селективного и экспрессного определения нейроме-диаторов и их метаболитов в биологических объектах.
• Разработаны способы иммобилизации комплекса {Eu³⁺–ОТЦ} в пленках хитозана, альгината и желатина, а также в альгинатном, альбуминовом, желатиновом, коллагеновом гидрогелях в ячейках 96-луночного полистирольного микропланшета. Показано, что для создания пленок наилучшей матрицей является хитозан, а для гидрогелей – комбинация альгината и коллагена.

Практическая значимость работы.
Разработаны флуоресцентные методики мультиплексного, высокочувствительного, селективного и экспрессного определения нейромедиаторов (дофамина (ДА), эпинефрина (АД), норэпинефрина (НА)[1], серотонина, L-диоксифенилаланина (L-ДОФА)) и их метаболитов (норметанефрина (НМН), 5-гидроксииндолуксусной (5-ГИУК), гомо-ванилиновой (ГВК) и ванилилминдальной (ВМК) кислот) в ячейках микропланшета в виде дериватизатов продуктов их пероксидазного окисления с 1,2-дифенилэтилендиамином и бензиламином, а также в виде их тройных комплексов с европием(III) и окситетрациклином. Диапазоны определяемых содержаний (ДОС) аналитов по реакции дериватизации составили 0.005 – 7.5 мкМ, пределы обнаружения (ПО) – 0.003 – 0.2 мкМ; по реакции комплексообразования ДОС – 0.01 –
10000 пМ, ПО – 0.005 – 300 пМ. ДОС указанных аналитов включают в себя их референсные концентрации в биологических жидкостях здорового человека, а также их пониженные и повышенные концентрации, фиксируемые у людей с различными патологиями. Предложенные методики успешно апробированы при определении нейромедиаторов и их метаболитов в плазме крови крыс и мышей, в моче здорового человека, в раковых клетках и нейронах.
Автор выносит на защиту:

• условия получения пленочных и гидрогелевых структур в ячейках
  96-луночного полистирольного микропланшета с иммобилизо-ванными в них компонентами индикаторных систем (пероксидазой или комплекса {Eu³⁺–ОТЦ}) для флуоресцентного определения маркеров нейромедиаторного обмена;
• способ флуоресцентного мультиплексного определения нейроме-диаторов и их метаболитов по реакции дериватизации с ароматичес-кими аминами продуктов их пероксидазного окисления, основанный на иммобилизации фермента в пленке хитозана в ячейках микро-планшета, направленном варьировании природы дериватизирующего агента, спектральных характеристик возбуждающего и испускаемого излучения, а также на применении производной спектроскопии 1-го порядка;
• способ твердофазного высокочувствительного определения аналитов по реакции образования ими тройных комплексов с Eu³⁺ и ОТЦ, иммобилизованных в пленках хитозана, альгината, желатина и в гидрогелях альгината, альбумина, желатина и коллагена;
• результаты изучения влияния матричных компонентов мочи и крови на определение маркеров нейромедиаторного обмена по реакциям дериватизации и комплексообразования; результаты определения нейромедиаторов и их метаболитов в моче здорового человека, в плазме крови мышей и крыс, в нейронах ганглий пиявок и раковых клетках кишечника человека.

Степень достоверности. Достоверность результатов обеспечена использованием комплекса современных инструментальных методов анализа (молекулярной абсорбционной и флуоресцентной спектрос-копии), статистической оценкой погрешностей и сходимости результа-тов измерений, а также высокой воспроизводимостью полученных результатов и их согласованностью с данными альтернативных методов анализа (ВЭЖХ-ЭХ).
Апробация работы. Результаты представленной работы доложены на XXII – XXV Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 2015 – 2018 гг.), II и III Всероссийских конференциях по аналитической спектроскопии с международным участием (Краснодар, 2015 г., Московский, 2017 г.), XXVI Ежегодном всемирном конгрессе по биосенсорам «Biosensors» (Швеция, Гетеборг, 2016 г.), XIV Курчатовской междисциплинарной молодежной научной школе (Москва, 2016 г.), Научной конференции грантодержателей РНФ «Фундаментальные химические исследования XXI-го века» (Москва, 2016 г.), V Международной конференции по биосенсорным технологиям «Bio-Sensing Technology» (Италия, Рива дель Гарда, 2017 г.), симпозиуме Европейского общества исследования материалов «E-MRS: Spring meeting» (Франция, Страсбург, 2017 г.), XIX Европейской конференции по аналитической химии «Euroanalysis» (Швеция, Стокгольм, 2017 г.), IV Международной конференции по биохимии и биоматериалам «NICE» (Франция, Ницца, 2018 г.), Международном конгрессе по биотехнологиям «Биотехнология: состояние и перспективы развития. Науки о жизни» (Москва, 2019 г.), Международной конференции по сенсорам «Single-Molecule Sensors and NanoSystems» (Германия, Мюнхен, 2019 г.).
Публикации. Основное содержание диссертационной работы опубликовано в 3 статьях в научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI, изданиях из перечня, рекомендо-ванных Минобрнауки РФ, 1 заявке на патент и 15 тезисах докладов на международных и российских конференциях.
Личный вклад автора. В диссертационной работе представлены результаты научных исследований, выполненных непосредственно автором. Личный вклад соискателя заключался в поиске, система-тизации и анализе данных литературы по теме работы; планировании, постановке и проведении экспериментов; обработке и интерпретации полученных данных; подготовке к публикации результатов проведен-ных исследований; а также в формулировке научных положений, выносимых на защиту, и выводов.
Структура и объем работы. Представленная диссертационная работа изложена на 225 страницах машинописного текста, включает
132 рисунка и 53 таблицы. Состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 7 глав, представляющих результаты исследований и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 392 источника, и приложения.