ВКР: Анализ гена BASP1 для исследования его роли в развитии рака молочной железы

СОДЕРЖАНИЕ

Содержание....................................................................................................................................1
Список сокращений.......................................................................................................................3
1. Введение....................................................................................................................................4
2. Обзор литературы......................................................................................................................6
2.1 Рак как заболевание………………………………………………………………………..6
2.2 Рак молочной железы………………………………………………………………...……7
2.2.1. Классификация типов рака молочной железы………………………………………8
2.3. Негенетические аспекты развития рака молочной железы…………………………….9
2.4. Генетические аспекты развития рака молочной железы………………………..…….11
2.4.1. Наследственная форма рака молочной железы……………………………...…….12
2.4.1.1. Гены с высоким уровнем пенетрантности……………………………………...12
2.4.1.2. Гены с умеренным уровнем пенетрантности…………………………...……...14
2.4.1.3. Изменения с низким уровнем пенетрантности…………………………...……15
2.4.2. Спорадическая форма рака молочной железы……………………………………..15
2.5. Эпигенетические изменения при раке молочной железы……………………………..16
2.6. Структура и функции белка BASP1…………………………………………………….18
3. Материалы и методы...............................................................................................................23
3.1 Банк крови...........................................................................................................................23
3.2. Выделение ДНК из замороженной крови………………………………………………23
3.2.1. Выделение ДНК коммерческим набором…………………………………………..23
3.2.2. Метод выделение ДНК с использованием SDS и высаливания белков ………....23
3.2.3. Выделение ДНК с помощью СТАВ и хлороформа ……………………...………..24
3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)…………………………………………………..25
3.4. Очистка ДНК…………………………………………………………………….……….27
3.4.1. Очистка ДНК с помощью твердофазной экстракции на колонках…...…………..27
3.4.2. Очистка ДНК методом прямого осаждения…………………………….………….27
3.5. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле………………………….…28
3.6. Электрофоретическое разделение ДНК в ПААГ…………………………………..…..28
3.7. Окраска полиакриламидного геля нитратом серебра……………………………...….29
3.8. Секвенирование по Сенджеру……………………………………………..……………29
4. Результаты и обсуждения.......................................................................................................31
4.1. Анализ последовательности гена BASP1 и подбор праймеров………………………31
4.2. Анализ BASP1 по базам данных мутаций и генетических вариантов……………….36
4.3. Оптимизация выделения ДНК из замороженной крови………………………………37
4.4. Оптимизация полимеразной цепной реакции (ПЦР)……………………………….…42
4.5. Исследование влияния различных условий на качество секвенирования …………..45
5. Выводы.....................................................................................................................................50
6. Список литературы..................................................................................................................51

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7-deaza-dGTP – 7-деаза-2`-дезоксигуанозин-5`-трифосфат
Bp – пара оснований
CDS – кодирующая последовательность
CK5 – белок цитокератина 5
CK5/6 – белок цитокератина 5/6
CKII – казеиновая киназа типа 2
CTAB – цетилтриметиламмоний бромид
dITP – 2`-дезоксиинозин-5`-трифосфат
dNTP – 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфат
EGFR – рецептор эпидермального фактора роста
ER – рецептор эстрогена
ERα – рецептор эстрогена α
HER2 – рецептор эпидермального фактора роста человека 2
PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа
PKC – протеинкиназа С
PKD – протеинкиназа D
PR – рецептор прогестерона
SNP – однонуклеотидный полиморфизм
TBE – трис-боратный буфер с ЭДТА
TEMED – тетраметилэтилендиамин
UTR – нетранслируемая область
ДМСО – диметилсульфоксид
ПААГ – полиакриламидный гель
ПСА – персульфат аммония
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РМЖ – рак молочной железы
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

1. ВВЕДЕНИЕ

Во всем мире рак молочной железы является наиболее распространенной формой рака, поражающей женщин. Особенностью данного типа рака является относительно высокий процент наследственных случаев заболевания (10% от всех случаев). Начало развития рака связано с изменениями в структуре ДНК клетки, чаще всего эти изменения затрагивают гены, являющиеся протоонкогенами, генами-супрессорами опухолей или генами репарации ДНК. Для наследственной формы рака молочной железы уже были обнаружены мутации в генах, которые обуславливают высокий или средний риск развития заболевания, а также однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), определяющие низкую предрасположенность к наследственному раку молочной железы. Однако, несмотря на значительные успехи в области изучения канцерогенеза, в 50% случаев наследственного заболевания причины начала развития рака не были обнаружены, поэтому до сегодняшнего дня активно ведутся поиски генов-кандидатов, нарушения в работе которых могут быть связаны с началом развития наследственного рака молочной железы.
BASP1 – ген, продукт которого играет важную роль в нейрогенезе и поддержании пластичности нервной системы. Кроме того, белок BASP1 обнаруживается в ооцитах, сперматозоидах и ранних эмбрионах позвоночных, участвует в поддержании плюрипотентного состояния клеток, а также участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. В последние годы появляется информация о связи BASP1 с канцерогенезом. Так было показано, что BASP1 может выступать в качестве супрессора для онкогенного транскрипционного фактора Myc и косупрессора для онкогенного транскрипционного фактора WT1. Также эктопическая экспрессия BASP1 снижает скорость миграции и пролиферации клеток при развитии лейкозов, опухолей щитовидной и поджелудочной желёз. Более того, при развитии разных форм рака наблюдается нарушенная экспрессия гена BASP1, что