Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.3. Структурная организация белка (947296), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Главное, однако, заключалось не в совершенствовании методических приемов, а в получении достоверных результатов и апробации постулированных принципов. Используемый в анализе тертиапина и МСВ-пептида способ разбиения последовательности на фрагменты не привел пока к быстрому решению задач, скорее наоборот. Его выбор был продиктован иными соображениями. Дело в том, что принятая в исследовании этих сложных пептидов процедура приближала к более глубокому пониманию механизма сборки природных последовательностей в нативные конформации. Авторы исходили из предположения, что метод расчета будет оптимальным в том случае, если он сможет моделировать реальный процесс самопроизвольного свертывания пептидной цепи в нативную конформацию.
Для этого необходима была предварительная идентификация нуклеационных участков цепи, существование которых на коротких фрагментах (5 — б остатков) ранее было обнаружено в работах, рассмотренных выше. Рациональный способ поиска нуклеаций не известен, в связи с чем попытались выявить конформационно-жесткие участки, инициирующис укладку развернутой пептндной цепи, путем тотального изучения ближних и средних взаимодействий на всех перекрывающихся фрагментах (этап 1, рис.
Ш.12). Можно было надеяться, что процедура отбора низкоэнергетических конформацнй даст наиболее надежные результаты, так как оптимальные по энергии конформации инициирующих участков могут служить своего рода "центрами кристаллизации" и входить в неизменном виде в ркончательную структуру молекулы, Все это были лишь предположения, ио достаточно правдоподобные и настолько заманчивые, что нельзя было ясг не опробовать.
За поиском компактно упакованных структур основной цепи, существенно выигрывающих по энергии на изолированных фрагмен,зэх, следовало рассмотрение взаимодействий нуклеаций друг с другом я с лабильными участками молекулы (этап 11). Для поиска нуклеаций были выбраны все перекрывающиеся по трем остаткам тетрапептидные фрагменты тертиапина. Тетрапептидный участок является оптимальным с двух точек зрения. При соответствующих упрощениях, о которых говорится ниже, анализ тетрапептида не требует предварительного рассмотрения его фрагментов, и в этом смысле он максимален из наиболее простых.
В то же время у тетрапептида уже может обнаружиться тенденция к образованию структур, существенно выигрывающих по внутренней энергии.На более коротких участках не обнаруясиваются решающие энергетические различия между формами основной цепи, не проявляется, например, ряд взаимодействий, существенных для стабилизации а-спирали и 13-складчатого листа. При предварительном анализе тетрапептидных фрагментов для каждого остатка учитывалась только часть его возможных конформаций, выбор которых ограничивался следующим образом.
Во-первых, не учитывались конформации всех амннокислотных остатков, кроме О)у, в области 1.; в К- и В-областях выбиралось по одной паре значений углов д и ~у. Во-вторых, вначале перебор конформационных состояний боковых цепей проводился только по углу то а значения других углов предполагались такими, которые чаще встречаются в белках (1.уз, Агй — дь уз,'у,4 — 180', Ве — уз — 180', Тгр — )1з— - 190', 1.еп — ~ь дз — 180, 60' и -60, 180'). Изменения углов уь дз, т4, как правило, влияют на энергию больших фрагментов, т.е. при участии боковых цепей 1.уз, Агй, 01и, 0!п в дальних взаимодействиях остатков, удаленных по цепи, но сближенных в пространстве. На коротких фрагментах у этих остатков разные комбинации значений углов уь )1з, )1д обычно близки по энергии. В-третьих, для последнего остатка каждого фрагмента В-форма не рассматривалась, так как она отличается от К-формы лишь ориентацией концевой пептндной группы, которая мало сказывается на энергии фрагмента.
Не учитывались также значения углов т~ - -60' для шервого остатка и у~ — 180' для последнего, поскольку в соответствуклцих конформациях боковые цепи слабо взаимодействуют с фрагментом. Изучение всех комбинаций выбранных таким образом конформаций аминокислотных остатков на тетрапептидных участках было начато с анализа фрагмента А!аз — Азпэ с последовательным перемещением по пептидиой цепи с шагом в один остаток Тетрапептидные фрагменты, на которых были обнаружены существенные энергетические различия между 'оптимальными конформациями разных типов, затем изучались более подробно.
Для ннх проводился перебор всех возможных форм основной цепи, причем в пределах В-области выбирались 2-3 пары значений углов ср, у, а в В-области — 1-2, соответствующих положениям локальных минимумов энергии монопептидов. На тетрапептидных фрагментах количество рас'смотренных локальных минимумов в пределах каждой формы основной цепи возрастало. Однако выбор значений д и ~у на основе минимумов 307 монопептидов, а также одновременный перебор конформаций по углу й~ позволяют обнаружить все низкоэнергетнческие структуры тетрапеа.
тидов. Такой анализ позволил исключить тетрапептиды 1 епз-Сузз а Тгр"-Сух'", на которых первоначально были обнаружены резкие энерге тические различия, из числа конформационно жестких фрагментов х выявить области пептндной цепи, где действительно формируются нуклеа. цни, инициирующие сворачивание молекулы.
После расчета фрагментов с нуклеациями проводилось постепенное наращивание пептндной цепи с отбором оптимальных конформаций лабильных участков. При этом а ннзкоэнергетических линейных структурах остатки цистеина автоматнче. ски оказывались сближенными, образуя дисульфидные связи без заметного изменения энергии и ограничивая тем самым конформационную подвижность молекулы.
На промежуточных этапах расчета остатки Суз заменялись А!а. При наращивании пептидной цепи для добавляемых остатков первоначально проводился перебор конформаций с различными значениями углов )(ь В некоторых случаях после анализа атомных моделей у низкоэнергетических структур проверялись также все конформеры по углам )(;у, тех боковых цепей, которые могли принять участие в новых взаимодействиях. При контакте между двумя боковыми цепями рассматривались все возможные комбинации значений углов т,-)(з обеих цепей.
Эта процедура всегда проводилась при анализе возможности образования днсульфидных связей и изучении конформацнонной подвижности всей молекулы. Учет ближних и средних взаимодействий у 18 рассмотренных тетрапептндов выявил следующую картину. У фрагментов Суза-11ез, Азпа-Ве' и Пе'е-Мебз, Рго" — Сузы (рнс. 111.13) обнаруживается тенденция к избирательной стабильности одного-трех родственных типов структур со свернутыми гпейпамн пептидного скелета (ф, е~и)уе), Оптимальные конформации отмеченных перекрывающихся тетрапептидов оказались идентичными по геометрии основной и боковых цепей на их общих участках (рис.
111.14), что позволило сделать вывод о наличии у тертиапниа двух нуклеаций: Суаз-Пез и 11е'а-Сузм, каждая из которых состоит из пяти аминокислотных остатков, включенных в а-спирали. На остальных участках молекулы тертиапина нет выраженных энергетических предпочтений. Следовательно, эти участки являются конформационно-лабильными на начальном этапе сворачивания пептидной цепи. Возможность образования первой дисульфидной связи изучалась на фрагменте Суаз-Суз'~. Сначала рассматривались возможные линейные конформации, а затем добавлялись квадратичные потенциалы, стягивающие атомы Б и СЯ соответствующих остатков цистеина на расстояния, отвечающие равновесной геометрии днсульфидной связи (см.
ниже) У тертиапнна могут в принципе реализовываться три системы связей Б-З: Суза-Суза и Сузы-Суз'а Суза-Суз'а и Суза-Сузы Суза-Суз" и Сузз — Суз'а. Однако первая система нереальна, поскольку связь межд)' остатками Суз, разделенными всего одним аминокислотным остатком энергетически не выгодна и не встречается в белках. Остатки Суз~ и Сузы (вторая система) также не могут образовать дисульфидный мостик, так как они расположены по разные стороны а-спирального участ- Таблица 11! 15 Относительная энергия фрагмента, ккал/моль Фариа основной цепи 0,0 0,0 0,0  — В К -Е 3,5 9,7  — К » 1,4 3,0  — К К -1.'" 1,7 ' Зля структур со сближенными СКатомами цистеинов, характеризующихся относительной энергией 0-6 ккалумоль. изучались возможные конформации дисульфидной связи.
'* Прн этой форме не удается сблизить Сэ-атомы цясгеииов иа расстояние < 5 А, лри катарам возможно образование дисульфидиай связи. К вЂ” В К-  — В йнзкоэнергетическне структуры основной цени фрагмента Сук-Суэг» тертнвпияа Линейнапэ Со сближенными СД- После образования атомами цистеинов' дисульфидиол связи »» К вЂ” 1. 1,! 2,9 3,6 » К -К 1,0 6,5 К -1, 2,5 8,0 Р. -К 2,0 9,8 рв с. !!!.!5. Трехмерная структура конформаннонно жесткого каркаса фрагмента А!а -Су! молекулы ! !8 тартнаннна комбинацией значений остатков Тгр!з Ьуз!а и 1 уз!т Выбор единственного способа упаковки участка Сук!е-Ьуз!т осуществляется только при формировании второй дисульфидной связи. В результате выяснено, что сближенность между остатками Суза и Суз'а имеет место лишь в оптимальной конформации линейного фрагмента Ьепз — Суз'".
Стерические напряжения не возникают только при согласованном изменении углов )(з Нее и )(з Ьуа'". При этом улучшаются взаимодействия боковых цепей остатков 11еа и Ьуа!т я образуется водородная связь е-аХНз-группы Ьуз!т именно с той карбонильной группой основной цепи, которая выпадает из системы водородных связей спирали Суза — 11е" при формировании первой дисульфидной связи.
Наличие такой тонкой согласованности взаимодействий различных участков пептидной цепи, достигнутой благодаря их точному геометрическому соответствию, по-видимому, служит веским доводом в польз> реальности рассчитанной структуры тертиапина. Следует подчеркнуть, что именно ван-дер-ваальсовы взаимодействия формируют структуры, в которых остатки Сузу и Суз'а, а также Суза и Суз'а оказываются сближенными на расстояние, необходимое для образования дисульфидных связей, расположение которых соответствует экспериментально полученной схеме. С другой стороны, только после образования этих связей избирательно стабилизируется единственная конформация основной цепи молекулы. Автоматическое сближение остатков цистеина при расчете плотноупакованных структур является хорошим контролем правильности найденной конформации, так как фиксация конформационных углов основной цепи допускает лишь незначительные (на 1,5-2 хт) изменения расстояний между СР-атомами цистеинов, необходимые для формирования дисульфидных связей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
