Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.3. Структурная организация белка (947296), страница 25

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 25)

Когда число их достигает критического значения, происходит переориентация боковых цепей, резкое снижение энергии невалентных взаимодействий и быстрый переход (схлопывание) белковой цепи в новое, более компактное конформациоиное состояние — расплавленную глобулу (вторая стадия сборки), которая по своим размерам и форме близка нативной структуре и отличается от нее главным образом лишь неспецифическими взаимодействиями аминокислотных остатков с окружающей средой. И, наконец, на третьей стадии формируется уникальная конечная конформация белковой молскулы путем подстройки промежуточной компактной структуры.

84 Определение ее как расплавленной глобулы, совпадающей с нативным «стоянием по вторичной структуре и топологии укладки основной цепи, но отличающейся от него отсутствием плотной упаковки боковых групп, представляется неудачным и по своей форме, и по содержанию. Первое становится очевидным, если поставить вопрос, имеющий отношение не только к самому термину, но и ко всей гипотезе: можно лн вообразить свертывание белковой цепи вне процесса, вне прохождения через ряд промежуточных состояний, и может ли одно из них не быть близко к нативному состоянию? Очевидно, это очень трудно, так же трудно, как, например, представить отсутствие сходства между близким к завершению строящимся зданием и его окончательной архитектурой. Определение расплавленной глобулы неправильно также по существу, поскольку ее вторичные структуры и форма основной цепи молекулы не могут сколько- нибудь близко подойти к нативной структуре без предварительного установления строго детерминированных контактов между подавляющим большинством внутренних боковых цепей, ибо именно этот вид взаимодействий обусловливает структурные особенности каждой природной аминокислотной последовательности.

Имеется еще одно возражение против гипотезы о расплавленной глобуле, использующейся вместе с аппаратом равновесной термодинамики и формальной кинетики для объяснения экспериментальных фактов. Конкретной теоретической основой интерпретации данных о денатурации служит термодинамическая теория двух состояний Брандтса [12, 13). Как уже отмечалось, белковая молекула в растворе, согласно этой теории, может быть представлена большим количеством микросостояний. Все онн входят в состав либо распределения Х (нативное макросостояние белка), либо Р (денатурированное макросостояние). Теория Брандтса сделала возможным относительно простой термодинамический анализ конформационного перехода Х вЂ” з Р в предположении, что реализующиеся микро- состояния не являются чем-то вновь созданным, а присутствуют в распределении Х и Р.

Это означает, что в теории постулируется отнюдь не очевидное положение об отсутствии новых промежуточных конформационных состояний в области перехода Х -э Р. Следовательно, главный критерий справедливости теории двух состояний Брандтса состоит в требовании отсутствия максимумов, минимумов и потенциальных ям в наблюдаемых изменениях энтальпии и энтропии при переходе от Р к Х (и наоборот). Иными словами, если образование трехмерной структуры белка происходит, как того требует теория двух состояний, путем постоянного усложнения и приближения к нативному состоянию, то изменения энтальпии, энтропии и свободной энергии по ходу ренатурации должны быть монотонными.

Отсутствие экстремумов означает отсутствие между нативной структурой и статистическим клубком метастабнльных промежуточных состояний. Механизм сборки белка проходит в этом случае в одну стадию. А теперь обратимая вновь к обсуждаемой гипотезе о расплавленной глобуле в которой постулнруется образование на пути к нативной структуре близкое к ней промежуточное состояние. При существовании достаточно устойчивых обнаруживаемых экспериментально интермеднатов зависимости изменений энтальпин, энтропии и свободной Вб энергии по ходу свертывания должны в этом случае содержать экстремумы, т.е. не быть монотонными. В то же время во всех положениях гипотезы подчеркивается последовательный характер усложнения структуры в течение всего процесса самосборки.

Возникшие на ранних стадиях вторичные и иные конформационные состояния направляют формирование более сложной н стабильной структуры, которые не переделываются, а лишь закрепляются на последующих стадиях. При такой организации глобулы зависимости энтальпии, энтропии и свободной энергии непременно должны быть монотонными, что свидетельствует об отсутствии метастабильных промежуточных соединений. Только что приведенное соображение о характере процесса самоорганизации белка, по существу, является формулировкой главного критерия сборки белка по одностадийному механизму, описываемому теорией двух состояний Брандтса [Х Ф ]3).

Следовательно, гипотеза о расплавленной глобуле одновременно декларирует два взаимоисключающих тезиса — наличие и отсутствие метастабильного промежуточного состояния, многостадийный и одностадийный механизм самоорганизации белковых молекул, т.е. является не только чисто умозрительной натурфилософской концепцией, но и внутренне противоречивой. Кроме того, она не оригинальна. Подобное и столь же умозрительное описание было сделано В.И.

Лимом около 20 лет назад [22]. Не более оригинальна и каркасная модель сборки белка, базирующаяся на постулате, непосредственно следующем из концепции Полинга-Кори о якобы энергетической предпочтительности регулярных вторичных структур, которые в связи с этим должны играть центральную роль в определении пути структурирования белковой цепи. Предполагается, что процесс сборки начинается с появления изолированных и на первых порах изменчивых вторичных структур [" мерцающих кластеров"). Взаимодействуя друг с другом, они вытесняют молекулы воды, стабилизируют свои структуры и посредством гидрофобных взаимодействий образуют единый, достаточно жесткий каркас третичной структуры [23, 24]. Близкое и столь же умозрительное представление о свертывании белковой цепи заложено в так называемой диффузионно-коллизионной модели [25, 26].

Аналогичные по существу механизмы сборки белка рассматривались также в работах [27, 28]. Важнейшим достижением в изучении механизмов структурной организации белков явились экспериментальные исследования Крейтона 1970- 1980-х годов, особенно его работы, посвященные эмпирическому подходу к изучению промежуточных состояний обратимой денатурации цнстннсодержащих белков [29, 30]. Разработанные Крейтоном методы позволяют идентифицировать дисульфндные связи, регулировать скорость их образования и разрушения и по последовательности возникающих промезхгуточных моно-, дн- и т.д.

Я-8-продуктов следить за ходом свертывания эелковой цепи. Предпринятое им на этой основе исследование пути свертывания панкреатического трнпсннового ингибитора [29] опережает и сейчас, по прошествии двух десятилетий, научный уровень аналогичных работ по ренатурации других белков. Подход Крейтона, однако, неприемлем для белков, лишенных 8-8-мостиков. долгое время белки, не содержащие остатков Суз, вообще считались еподходящими объектами изучения механизма свертывания. Ситуация начала меняться во второй половине 1980-х годов в связи с разработкой а, Ферштом еще одного варианта эмпирического подхода [11], который после необходимой коррекции может обрести значительный научный потенциал [2). Подход универсален в изучении структуры и стабильности конечных и промежуточных состояний белковой цепи вне зависимости от присутствия остатков Суз.

Он включает целый комплекс различных экспериментальных методов, но своим появлением обязан становлению в начале 1980-х годов генной инженерии, сделавшей доступными практически любые полипептидные последовательности стандартных аминокислот. В результате появилась возможность иметь сколь угодно представительный набор искусственных белковых аналогов, отличающихся от природного объекта числом н местом аминокислотных замен. Такие сайтспецифические белковые мутанты могут служить инструментами или зондами, позволяющими получать тонкую структурную информацию о процессе самоорганизации белка, недоступную никаким другим путем, Появление вместо одного объекта исследования набора целенаправленно модифицированных аналогов повышает интерпретационные возможности многих экспериментальных методов (ЯМР- и КД-спектроскопии, методов остановленной струи, изотопного обмена и др.), особенно при их комплексном использовании.

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33).

Изучение обратимой денатурацин начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии.

Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний.

Характеристики

Список файлов книги