Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.3. Структурная организация белка (947296), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Полученные результаты явились полной неожиданностью. Лнзоцим в отношении вторичных структур существенно отличался от миоглобина и гемоглобина; его спиральные фрагменты содержали не 75% 73 всех остатков белка, как у первых двух, а менее трети, причем почти все они были сильно искажены и в них отсутствовали а-спиральные пептидные водородные связи (5 -> 1). Фактически в пространственной структуре лизоцима нет регулярных участков; лишь при большой фантазии и сильном желании, которые были проявлены, к ним смогли отнести только несколько коротких а-спиралей и один небольшой сегмент 13-структурьь В конце 1960 — начале 1970-х годов стали известны трехмерные структуры папаина, химотрипсиногена, а-химотрипсина, 11-трипсина, эластазы, стафилококковой нуклеазы, рибонуклеазы и некоторых других белков.
Во всех случаях ситуация коренным образом отличалась от миоглобина и гемоглобина. Перечисленные белки содержали не более, чем у лизоцима, и столь же нерегулярные и-спирали н Р-структурьь После классических работ Перутца, Кендрью и Фнллипса кристаллография белков стала быстро развиваться во многих научных центрах.
К 1970 г. с помощью рентгеноструктурного анализа были получены трехмерные структуры 18 белков, к 1975 г. — 79, к 1979 г. — !61, к 1989 г.— 400. Сейчас это количество приближается к трем тысячам. Одновременно кристаллография белков все больше приобретает для биологии универсальное значение и, наконец, становится неотьемлемой частью исследований, направленных на решение фундаментальных научных и прикладных задач.
В настоящее время знание молекулярной пространственной структуры во многом определяет уровень работ и значимость получаемых результатов. По прошествии более трех десятилетий со времени расшифровки структур миоглобина и гемоглобина рентгеноструктурный анализ все еще остается единственным прямым методом определения на атомном уровне пространственного строения белковых молекул, их комплексов и доменов. Полученные с его помощью данные по-прежнему служат незаменимой экспериментальной основой изучения структурно-функциональной организации молекул белков.
В 1990-е годы этот метод, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, позволил приступить к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного роста возможностей кристаллографии белков связана с использованием вместо излучения рентгеновских трубок синхротронной радиации, Переход к новому источнику рентгеновского излучения ослабил требования, предъявляемые к размерам кристаллов, что особенно важно в структурном анализе высокомолекулярных белков и сложных комплексов, имеющих крупные элементарные ячейки.
Сплошной спектр синхротронной радиации и легкость выбора любой длины волны монохроматического излучения сделали возможным подойти к решению фазовой проблемы и разработать метод мультиволновой аномальной дифракции, требующий для решения фазовой проблемы лишь одного кристаллического образца. Существенным дополнением к этому методу стал генноинженерный способ получения в ауксотрофных клетках аминокислотиых последовательностей, в которых все остатки метионина заменены на селенометионин. Использование [Зе-Ме1]-белков не только освобождало 74 год рентгеносгруктурного анализа от длительной рутинной процедуры „риготовления нескольких изоморфных белковых производных тяжелых гомов, но практически сняло проблему изоморфизма.
И, наконец, применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, несравненно более мощного излучения рентгеновской трубки, снизило, по крайней мере, на два-три порядка время зкспозицин. Значение зтого факта трудно переоценить, так как для установления трехмерных сгруктур на атомном уровне впервые стали допустимыми промежуточные соединения физиологических реакций. Если до недавнего времени рентгеноструктурный анализ являлся фактически единственным прямым методом исследования нативных конформацнй белковых молекул с атомным разрешением, то сейчас он становится источником (также единственным) столь же детальной информации о пространственном строении промежуточных соединений.
Таким образом, ближайшие перспективы зкспериментального изучения пространственного строения белков, если судить по наметившейся тенденции, будут определяться достижениями в использовании синхротронной радиации. Существенных результатов можно ожидать от совместного применения рентгеноструктурного анализа белков с методами малоуглового рассеяния, криомнкроскопии и многочисленными методами молекулярной спектроскопии. Среди последних ценен метод ЯМР, быстро прогрессирующий в последнее десятилетие.
Его применение иа гетероатомах и использование трехмерной спектроскопии ЯМР привело к упрощению анализа спектров и повышению его информативности в исследовании сложных структур. 1.3. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКА Влияние, которое оказали результаты рентгеноструктурного анализа белков на изучение их фракций, детально рассматривается в следующем томе настоящего издания. Здесь хотелось бы обратить внимание на то, что наличие уже в течение нескольких десятилетий уникальной структурной информации все еще не привело к концептуальному развитию нли переосмыслению представлений о природе и принципах функционирования белков, сложившихся до становления кристаллографии макромолекул.
Ставшие доступными данные рентгеноструктурного анализа о пространственном строении белковых молекул не вызвали качественных изменений в понимании биокатализа, гормон-рецепторных взаимодействий и многих других явлений. Функционирование биосистем молекулярного уровня не обрело строгой трактовки в рамках сформулированных ранее концепций ферментативных и иных реакций, равно как и последние не получили на основе структурных данных своей объективной оценки.
По-прежнему, фундаментальные различия между обычными химическими реакциями в растворе и реакциями, осуществляемыми ферментами, продолжают видеться в напряжении и деформации субстрата при его сорбции в активном центре в сторону переходного состояния, в индуцированном соответствии и принудительных конформационных изменениях фермента, в его изна- 75 чальной или приобретаемой в процессе катализа неравновесности и т.д, Появление данных рентгеноструктурного анализа белков не изменило традиционной направленности зизимологических исследований "от функции к структуре" или "от сложного к простому".
И зто не случайно. Отмечая редукционистский характер биологических исследований, А. Эддингтон в 1958 г, писал, что согласно общепринятой точке зрения "все, достойное внимания науки, может быть открыто лишь путем рассечения объектов на микроскопические части" [6. С. 103~. Действительно, достигнутые в последующие десятилетия молекулярной биологией успехи оказались столь впечатляющими, что и сейчас цель проводимых исследований почти повсеместно отождествляется с "рассечением объектов на микроскопические части". Между тем, за зто время ситуация претерпела качественные изменения, вызванные, прежде всего, развитием биологии молекулярного уровня. В немалой степени зтому способствовали результаты рентгеновского анализа белковых молекул. Кристаллическая структура белка — это очень сложным образом полученная и, по-видимому, самая дорогая во всех отношениях фотография.
Представленное на ней изображение позволяет увидеть многие детали внутреннего устройства белковой глобулы. Но, как и любая другая фотография, она не раскрывает природы внутренних связей и принци. пы организации изображенного объекта, его возможного поведения при изменении внешних условий. Кристаллография белка — это морфология биосистемы молекулярного уровня. Для перехода к изучению физиологии белка одной фотографии кристаллической структуры белка, т.е, одной морфологии, недостаточно.
На приведенной ниже схеме показана цепочка субординацнонных взаимоотношений между функцией белка (в данном случае, фермента) и его химическим и пространственным строением. Из схемы видно, что наблюдаемая структура белковой молекулы не имеет непосредственной связи с реализуемой каталитической функцией. Существующая же связь, во-первых, направлена не от функции к структуре, а от структуры к функции, т.е, в сторону, противоположную традиционному направлению поиска, и, во-вторых, включает три промежуточных звена и требует последовательного решения трех задач. 76 Первая задача заключается в изучении структурной организации и создании теории, устанавливающей логическую и количественную взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой белка, предсказывающей его конформационные и электронные свойства. Цель следующей задачи состоит в изучении физико-химических свойств белка и, основываясь на знании не только геометрии, но и структурной организации белковой молекулы, выявлении принципов ее функционирования, иными словами, разработке теории структурно-функциональной организации белка.
Третья задача направлена иа создание общей теории рассматриваемой функции (здесь биокаталитической), учитывающей решения предшествующих задач, особенности ферментативного катализа, физико-химические основы этого явления и возможности современного естествознания. Работа по установлению структурной организации белка проводится обычно с помощью двух эмпирических подходов, дополняющих друг друга и имеющих единую цель.
В рамках одного из них задачу стремятся решить, пытясь предсказать нативную конформацию белка по известной аминокислотной последовательности, в рамках другого — воспроизвести механизм формирования этой конформации по ходу рибосомного синтеза в условиях 1п чггхо нли исходя из состояния флуктуирующего статистического клубка в условиях 1п чйго. Практически во всех исследованиях, отвечающих первому подходу, предпринимались (и продолжают предприниматься) попытки найти достаточно простые эмпирические корреляции между природой и последовательностью аминокислот, с одной стороны, и конформационными состояниями остатков в известных кристаллических структурах белков, с другой.
В подавляющем болылинстве работ эмпирические правила были выведены путем сгатистического анализа белков, изученных рентгеноструктурно. В ряде исследований привлечены термодинамические функции перехода спираль — клубок синтетических полнпептидов, использованы атомные модели, стереохимические правила и экспериментальные данные физико-химических методов; есть исследования, в которых эмпирический подход сочетался с расчетом сверхупрощенных моделей пептидной цепи. Исследования механизма свертывания, отвечающие второму подходу к установлению структурной организации белка, базируются на многочисленных физических, химических и биологических методах исследования, которые дают прямую или косвенную информацию о геометрических, термодинамических и кинетических аспектах процессов денатурации и ренатурации, механизме клеточного синтеза аминокислотной последовательности и взаимодействия белковых цепей с шаперонами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
