Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.3. Структурная организация белка (947296), страница 129
Текст из файла (страница 129)
Таким образом, свертывание полипептидной цепи БПТИ как будто бы отвечает элементарным требованиям, которым должен удовлетворять жный процесс, чтобы быть надежным и быстрым. Наблюдаемый анизм сборки белка, на первый взгляд, представляется недостаточно едовательным, усложненным излишне большим количеством прямо не ванных ни с начальным, ни с конечным состоянием промежуточных уйо дуктов и, следовательно, перегруженным многочисленными перехоягми между ними. Чтобы понять неизбежность и необходимость всего йпго, что совершается самопроизвольно в реальном процессе организации ~рехмерной структуры ВПТИ, требуется ответить на следующие конкфтные вопросы. 1.
ПочемУ ди-ББ-продукт (Суз — Сух~~, Суззо-Сузы) не мог быть обраван сразу же из первоначального монодисульфидного производного со зью Суз'в-Сух~'? Чем вызвано превращение моно-ББ-производного фуззе — Сузы) в различные ди-ББ-продукты, их последующее разрушение с приторным возвращением к тому же монопроизводному? 2, В чем причина максимальной устойчивости у моно- и ди-ББ-метаязибильных промежуточных состояний дисульфидной связи Сузз"-Сузи? 3.
Почему не могла быть реализована еще одна возможность в выборе долее короткого пути свертывания через прямой перевод ди-ББ-продукта ануя'4-Сузза, Суззе-Сузы) в нативную трехмерную структуру белка путем ° бразования третьей дисульфидной связи Сузз — Сузы? Перед тем как ответить на эти вопросы и приблизиться к пониманию йайствительного механизма свертывания полипептидной цепи БПТИ, иапомним некоторые особенности рассматриваемого явления ренатурации денете предложенной неравновесной термодинамической теории и физической теории структурной самоорганизации белков. Во-первых, все сойытия, совершающиеся в процессе свертывания полипептидной цепи белковой молекулы, являются беспорядочными; возникновение как обрати~аых, так и необратимых флуктуаций имеет исключительно случайный карактер.
Во-вторых, флуктуации тем более необратимы, чем ближе они йодводят пространственное строение фрагментов белковой цепи к конфорМационным состояниям, реализующимся в нативной структуре молекулы В-третьих, появление актуальных для каждой стадии свертывания белка необратимых флуктуаций всегда неизбежно и своевременно.
Механизм структурной самоорганизации белка — это спонтанная трансФормация случайных конформационных отклонений в строго направленную и детерминирующую процесс последовательность событий. Автомахпзм процесса гарантирован возможностью осуществления на любой стадии сборки белка перебора всех комбинаций случайных флуктуаций, включающих необратимые, бифуркационные флуктуации. В самом начале ренатурации механизм свертывания полипептидной цепи представляет 479 собой, по существу, аддитивную сумму нескольких процессов, возникая.
щих одновременно и идущих параллельно, практически независимо друг о„ друга на нескольких участках. Каждый из них включает сборку ве. большого (-10 остатков) олигопептидного фрагмента в конформационио жесткую нуклеацию. Как уже отмечалось, беспорядочно-поисковый меха. низм здесь по продолжительности вполне приемлем и неизбежно приведе~ к возникновению бифуркационной комбинации необратимых флуктуация По ходу дальнейшей сборки во взаимодействия вовлекается все больше~ число остатков, что, однако, не снижает скорость процесса и не ставит псд сомнение реальность беспорядочного перебора случайных отклонении Включение дальних взаимодействий сопровождается резким сокращением конформационных степеней свободы и количества возможных флуктуаций С течением процесса вероятность возникновения необратимых флуктуа.
ций возрастает, достигая максимума в самом конце сборки. При рассмотрении механизма ренатурации БПТИ состояние белковой цепи на пути от статистического клубка к нативной конформации оценивалось, следуя Крейтону [7), по дисульфидным связям (см. рис. 1У.17) Считалось, что чем болыпе их число и чем ближе они подходят к системе дисульфидных связей конечной структуры, тем дальше продвинулся процесс сборки. При экспериментальном изучении ренатурации белков альтернативного, столь же надежного способа идентификации структуры промежуточных метастабильных состояний практически нет. Действительно, дисульфидная связь является удобным критерием.
Она указывает на сближенность определенных участков белковой цепи на этапах свертывания, надежно характеризует как исходное, полностью денатурированное состояние, так и конечную, нативную трехмерную структуру. И тем ие менее способ идентификации промежуточных состояний только по дисульфидным связям не может пролить свет на многие важные детали механизма ренатурации и ответить иа поставленные вопросы.
Возникновение этих связей является следствием, а не причиной самоорганизации белковой цепи. По дисульфидному признаку неразличимы, например, два моно-55-продукта с мостиком Суззв-Сузз', один из которых возникает в самом начале свертывания из статистического клубка, а второй — в конце сборки, после частичной деструкции ди-ББ-продуктов (Сузз — Суз'4, Суззе — Сузы) и (Сузз-Суззз, Суззв-Сузы). На самом же деле конформационные состояния двух моно-Ы-продуктов с дисульфидной связью Суззв-Сузы имеют мало общего между собой. В первом производном в лучшем случае близки к завершению структуры конформационно жестких по средним взаимодействиям нуклеаций Агу'-Ргоз, Р)зезз-Ст!пз' и А!а4а-01узь.
Его переход к ди-Ы-производному (Сузз — Сузы Суззв-Сузы) или (Суз'4-Суззз Суз'"- Сузы) маловероятен по двум причинам. Во-первых, из-за сохранившегося у белковой цепи на этой стадии сборки большого количества степеней свободы, допускающих реализацию множества конформационных состоя. ний лабильных участков, разделяющих нуклеации. Беспорядочный пере бор всех случайных отклонений и селекция необратимых флуктуаций требуют пока длительного времени. Но это даже не самое важное. Главна" 55 причина невозможности образования иа стадии сборки связи Суз -Сух Пи Суа'4 — Сузза) заключается в отсутствии у первого моно-88-продукта опий, необходимых для превращения соответствующих конформацион5х отклонений в необратимые.
Для появления бифуркационных комбиций неравновесных флуктуаций нужно, чтобы случайные отклонения и к созданию самых предпочтительных по энергии структур, имеющих ибольшее число стабилизирующих межостаточных контактов. Расчет нформацнонных возможностей всех участков белковой цепи БПТИ, ако, показал, что возникновение актуальных для сближенности остат- В Сузз И Суааа И ОбраЗОВаНИя МЕжду НИМИ 8-Б-МОСтНКа ЭНЕрГЕтИЧЕСКИ годных конформацнонных отклонений можно ожидать лишь на заклютельной стадии построения ))-структуры. В работе (11) показано, что а структура при сборке БПТИ служит матрицей для укладки лабильных астков как со стороны Х-конца, так и со стороны С-конца белковой пи.
Необратимые флуктуации, возникающие в белковой цепи до окончания рки 1)-структурьц приводят к образованию вторых дисульфидных язей между Сузз н Суз'4, Сузз и Сузза (см. рис. 1Ч.17). Независимый счет подтвердил, что конформации получающихся при этом ди-ЯЯ-про- тов обладают на соответствующих этапах ренатурации минимальной ергией и включают в основном состояния остатков нативной структуры. ким образом, после появления нуклеаций Агй'-Ргоа, Р)5езз-01пз', А1а4"— узб и образования дисульфидной связи Суззв-Су55' создаются стеричеие условия, благоприятные для появления необратимых флуктуаций, дущих сначала к ди-БЯ-продукту (Су55 — Суз'4, Суззо — Сузз'), а затем— (Сузб — Сузза, Суззв — Сузз'), Предпочтительность обоих ди-Ю-продуктов сит, однако, временный характер и приведшие к иим флуктуации азываются псевдонеобратимыми.
По мере структурирования цепи ергия конформационных состояний локальных участков с дисульфид5ми связями Сузз-Суз'4 и Сузз-Сузах возрастает, поскольку, как показал счет, они препятствуют образованию многочисленных дальних контакв. Наличие же у продуктов второй дисульфидной связи Сузаб-Су55', против, способствует ренатурации белка, сближая его С-конец с )э-струкрой и конформационно жестким Х-концевым фрагментом Агй' — Ргоа. оэтому в результате развития процесса свертывания цепи дестабилизи- ются связи Су55-Суз'4 и Су55 — Сузза и стабилизируется связь СуззоУзм После завершения построения 15-структуры возникает третий ди-оэродукт с двумя нативными дисульфндными связями Суз'4-Суз'" и уазо-Сузз'.
Он отличается излишней конформацнонной жесткостью, корая не позволяет преодолеть серьезные стерические ограничения на к сближению Х- и С-концевых участков белка и созданию третьей тивной дисульфидной связи Су55-Су555. Иными словами, здесь не возкают соответствующие неравновесные флуктуации, ведущие к низкоергетической сближенности боковых цепей остатков Сузз и Су555. роцесс ренатурации БПТИ, как свидетельствует эксперимент Крейтона, звивается через повторное создание моно-ээ-производного с дисульидной связью Сузи'-Су55' из нестабильных дн-эЯ-продуктов.
Однако его онформационное состояние отлично от сосгояния моно-Яэ-производного, Проблема белка, т. 3 481 образующегося в самом начале свертывания белка. Если структура рав него моно-БВ-продукта в большой мере отвечает статистическому клубку то структура второго продукта с той же дисульфидной связью — нативнов конформации белка. В ней в уже завершенном виде присутствуе 1»-структура, около которой в основном находятся лабильные по средиии взаимодействиям участки (сначала Ргоз-Суз'4, затем Су»»"-А!а""), чт„ автоматически приводит к сближению остатки Су»» и Су»»». По-видимому отсутствие у этого продукта мостика Су»'4-Су»»а оставляет свободу, не. обходимую и достаточную для конформационных изменений, сопутствукь щих образованию дисульфидной связи Суз» вЂ” Су»»».
Пространственное строение ди-ээ-продукта (Су»»-Су»»», Суз»в-Су»»') не отличается от зн строения нативного белка с восстановленной связью Су»м-Су»»а Щн) (см рис. 1Ч.17). Т. Крейтон показал, что среди всех ди-88-метастабильнь»х производных это промежуточное состояние является наиболее стабильным. Свой обратный переход оно совершает очень медленно с периодом полураспада около 10 ч, В то же время образование третьей дисульфидной связи и обращение в нативное состояние требует всего 12 мкс. Итак, завершено рассмотрение опытных данных Крейтона о механизме сборки трипсинового ингибитора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
