Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 99
Текст из файла (страница 99)
Противоречат теории Брандтса результаты обсужденных ранее исследований Икаи и Тэнфорда [49], Тейпеля и Кошланда [51], Эпштейна и соавт. [52], Гарела и Болдвина [54] и др. Предложенные в этих работах кинетические уравнения механизма денатурации не могут быть сведены нн к простейшему, ни к расширенному вариантам уравнения двухфазного перехода (Х ~~ Р), подобного фазовому переходу первого ряда.
Глава 13 РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ ДИСУЛЬФИДНЫЕ С(:ГРЯЗИ В своей статье, опубликованной в 1992 г., Е. Лэттман и Г, раузе анализируя некоторые особенности укладки белковой цепи в нативную конформацию, дают следующую оценку научной значимости проблемны свертывания белка и сегодняшнему состоянию ее разработки. "Несмотря на интенсивные исследования, обобщенное гфизическое понимание процесса свертывания остается туманным, а сама проблема свертывания белка, т.е.
понимание того, как амине»кислотная последовательность определяет трехмерную структуру, еще ждет своего решения.... эта проблема предстает как один иы наиболее значимых научных вызовов 20-го века" 1109. С. 4391. Аналогичные высказывания содержатся в работах многих исследовате-лей, в том числе таких авторитетов в этой области, как Т. Крейтон и А.
Фершт. Первый полагает, что наука по существу еще не приблизилась к решению проблемы свертывания белка 1181, а второй, отмечая сложность проблемы, называя ее даже "устрашающей задачей" 1"йапв1]пя 1азк"), пишет: "Выявление принципов, управляющих сверзтыванием, представляет громадную нерешенную проблему, посксзльку еще невозможно рассчитать де почо путь свертывания белим или даже выяснить является ли известная структура стабильной" (110. С. 5], Действительно, проблема структурной самоорганизацни белка— это целый комплекс сложнейших экспериментальных и теоретических задач.
Однако главная трудность их решения, по нашему мнению, состоит в отсутствии аналогий, так как спонтанное возникновение трехмерной структуры белка является уникальным явлением живой природы. С физической точки зрения это явление заключается в самопроизвольной трансформации энергии хаотического движения в целенаправленную механическую работу создания вьзсокоорганизованной молекулярной системы. Белки представляются гзочти единственными в природе (по меньшей мере, самыми соверпсзенными и распространенными) автоматическими преобразователяьхи энергии теплового и броуновского движения в энергию более высоко»го ранга— механическую и энергию стереоспецифических внутримол екулярных взаимодействий.
Появившаяся спонтанно из хаоса упорядоченная трехмерная структура белка далее способна к трансформации всех других, необходимых для жизни видов энергии, Присупхая белкам способность к структурной самоорганизации есть элехиентарное фундаментальное качество живой материи, обуслов.ливающее специфические особенности биологических систем всех посшедующих ступеней иерархической лестницы живою. Проблема свертывания белка, по нашему мнению, мсзжет быть разделена на следующие пять взаимосвязанных задач. 1. Раскрытие кинетического механизма пространствехчной само- организации молекулы белка, т.е.
установление всех промежуточных форм белковой цепи на пути ее свертывания от состояния статно тического клубка до нативной биологически активной трехмернои структуры, 2. Разработка общей теории свертывания белковой цепи, т,е системы принципов, отражающих все важнейшие особенности струк турной самоорганизации молекулы белка: беспорядочно-поисковый механизм сборки природной аминокислотной последовательности самопроизвольный характер возникновения и протекания всех стадий образования высокоупорядоченной трехмерной структуры, высокая скорость и безошибочность процесса. 3.
Создание физической теории структурной организации молекул белка и соответствующего расчетного метода, позволяющих предсказывать только на основе известной аминокислотной последовательности координаты всех атомов нативной трехмерной структуры и количественно оценивать ее конформационные возможности. 4. Количественное априорное представление спонтанного свертывания конкретной белковой цели в нативиую трехмерную структуру как неизбежный результат действия беспорядочно-поискового механизма. 5.
Решение обратной структурной задачи, т.е. создание теории и метода, позволяющих целенаправленным и контролируемым образом изменять аминокислотную последовательность по заранее заданной пространственной структуре мутантного белка. Вплоть до последнего времени изучение проблемы свертывания белка было направлено прежде всего на поиск экспериментальных методов исследования промежуточных состояний, т.е.
на решение первой задачи. Что касается второй задачи, то многочисленные попытки ее реп~ения чисто эмпирическим путем вот уже несколько десятилетий скользит по поверхности гипотетическо-феноменологического уровня. К рассмотрению трех последующих задач еще ьообще яе приступали, поскольку для этого необходимо решение двух предшествующих. Важнейшим досгижением в познании механизма структурной самоорганизации белковых молекул, явились работы Т.
Крейтона 1970— 1980-х годов, особенно посвященные экспериментальному исследованию пути свертывания панкреатического трипсинового ингибитора в созданию общего подхода к анализу процесса обратимой деиатурации , цистеинсодержащих белков (гл, 12). Комплекс аналитических методов, как созданных самим Крейтоном, так и известных ранее, позволил надежно идентифицировать дисульфидные связи и управлять процессом их образования и разрушения, что сделало возможным следить за ходом свертывания белковой цепи по промежуточным Б — $-продуктам Разработанный подход, очевидно, неприемлем для белков, лишенных осгатков Суз или не образующих днсульфидных связей.
Кроме того, он нс мог быть использован и для более детального исследования самих пистеинсодержащих белков, так как позволяет судить о последовательности образующихся по ходу сборки промежуточных продуктов и 384 оисходящих при этом конформационных изменений лишь по "скольким точкам, отвечающим появлению одной, двух, ... 3 — 3- язей. По-видимому, нет оснований считать, что белки, не держащие 3 — З-мостиков, укладываются в натнвную конформацию )принципиально иначе, чем белки с такими мостиками.
Поэтому ')нссяериментальное изучение механизма нх ренатурации, неизбежно чребующее создания более тонких методов структурного анализа а1ромежуточных состояний (по сравнению с методами дисульфидных князей), имеет общее значение в исследовании свертывания белковой цешь 13.1. САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ Долгое время белки, не содержащие остатков Суз, считались неудобными объектами изучения механизма све]ггывания, и уровень их исследований в этом плане значительно уступал цистеинсодержащим белкам. Ситуация начала меняться во второй половине 1980-х годов н к настоящему времени две группы белков, если не поменялись местами, то во всяком случае сравнялись по проявляемому к ннм вниманию и результатам исследования.
Повышенный интерес к белкам без йнсульфидных связей был вызван появлением универсального экспериментального метода А. Фершта, открывшего широкие перспективы, перед исследованиями структуры н стабильности всех состояний белковой цепи на пути ее свертывания [110 — 113].
Он будет предметом детального анализа в этом и следующем разделах. Но сначала несколько слов о предшествующих работах в данной области. В 1972 г. Д. Саче и соавт. [114) разработали иммунологический метод, который был использован для изучения процесса ренатурацни белков, не содержащих дисульфидных связей. Метод основан на предположении о двухфазном механизме свертывания и идентификации конформационных состояний фрагментов нативной трехмерной структуры белка с помощью специально подобранных антител.
Далее выявляются зависимости между константой равновесия предельных состояний (Р и Х) н константами связывания антител с белковыми фрагментами. Д. Саче и соавт. [115] применили метод для определения константы равновесия ]к] ~< — Р стафнлококковой нуклеазы, а Дж. Харрел и соавт.
[116) и Б. Фурье н соавт. [117) — для изучения конформаций промежуточных состояний миоглобина. О характере получаемой при исследовании иммунохимического метода информации можно судить по результатам рассмотренной в разд. 9.4. работы Л. Чавеца и Г. Шсраги [86), прнменивших его в исследовании ренатурации рибонуклеазы А. Известно несколько попыток фиксировать процесс сборки белка быстрым понижением температуры с последующим определением промежуточных продуктов с помощью электрофореза [118] и ЯМР спектроскопии [119]. Несмотря на положительное значение полученных результатов, они имели, однако, частный характер н не оказали 13. Проблема белка, т. 2 385 заметного влияния на ситуацию с исследованиями белков, в трех мерных структурах которых отсутствуют дисульфидные связи.
В кинетических исследованиях слежение за процессом свертывания белковой цепи осуществлялось методом флуоресценции или пог лощения. Полезная информация, имеющая, однако, также интегральный характер. получалась с помощью спектров кругового дихроизма, метода, чувствительного в области 220-230 нм к содержаник> и- спиралей [120]. Более детальные сведения о процессе давало совместное использование методов остановленной струи, ЯМР и изотопного обмена Н/]3 н Н/Т, позволяющих не только определять общее содержание вторичной структуры, но и фиксировать ее образование в отдельных местах аминокислотной последовательности [121 — 124]. Обратимся теперь к методу Фершта, точнее подходу, включающему целый комплекс методов.
Своим появлением он обязан становлению в начале 1980-х годов генетической инженерии, сделавшей доступными любые полипептидные последовательности стандартных аминокислот. В результате открылась уникальная возможность получения сколь угодно представительного набора искусственных белковых аналогов, отличающихся от природного объекта числом и местом аминокислотных замен [125, 126], На основе сайт-направленного мутагенеза был разработан метод экспериментальной оценки энергии невалентных взаимодействий, впервые опробованный при изучении функционирования тирозил-тРНК-синтетазы [127 — 129]. Выявив в этих работах возможность получать количественные данные о структуре и энергетике боковых цепей при изменении аминокнслотной последовательности, Фершт и соавт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
