Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 98
Текст из файла (страница 98)
Уетлауфер проанализировали смесь продуктов ранней стадии реоксидации лизоцима кислородом воздуха в присутствии ионов Сим [96]. Они обнаружили несколько продуктов метастабильных состояний с 8 — 5-связями из 36 возможных в принципе и пришли к заключению о наличии немногочисленных путей свертывания белковой цепи. У. Андерсон и Д. Уетлауфер проследили развитие процесса ренатурации лнзоцима с помощью восстановленного и окисленного глутатиона [97]. Скорость образования дисульфидных связей, по их данным, опережает, точно так же, как у рибонуклеазы, восстановление ферментативной активности. Тем не менее авторы предположили прямой путь реставрации нативной конформации лизоцима только через продуктивные метастабильные состояния, не требующие переориентации дисульфидных связей.
Однако выводы авторов о механизме сборки лизоцима нельзя считать достаточно обоснованными. В работе не были локализованы дисульфидные связи в продуктах, образованных на разных стадиях процесса, не была исключена возможность создания межцепочечных 8-8-связей и не приведены доказательства отсутствия таковых. Кроме того, нет уверенности в идентичности промежуточных продуктов, полученных в результате тиол-дисульфидного обмена и фиксированных блокировкой тиольнык групп белковой цепи ]чэтилмалеимидом, так как до блокировки добавлялась мочевина (4 М), направляющая, как известно, процесс в обратную сторону с вероятным перераспределением связей 8-8.
А. Ачариа и Г. Таниучи «98] исследовали катализируемое ионами Спы окисление на воздухе восстановленного лизоцима с использованием гель-фильтрации для разделения промежуточных продуктов, находя- шихся на разных этапах сборки нативной конформации. Наибольшее внимание было уделено состояниям ранней стадии ренатурации. При этом, однако, были использованы заниженные концентрации йодацетата и в некоторых случаях добавлялась мочевина (б М); несколько отличающиеся процедуры фиксации давали различные спектры улавливаемых продуктов, что указывает на неадекватность использованных методов, В работе тем не менее было показано, что содержание неправильно свернутого белка растет с увеличением скорости окисления.
В своей следующей работе Ачариа и Таниучи [99] попытались определить положения остатков Суз в цепи лизоцима, образующих дисульфидные связи в промежуточных состояниях, обязательных для укладки физиологически активной трехмерной. структуры лизоцима. С этой целью остатки цистеина последовательно подвергались необратимому блокированию. Однако никаких данных, подтверждающих наличие продуктивных метасгабильных продуктов, получено не было. Т. Крейтон, анализируя эту работу, полагает, что окисдение денатурированного белка в теченив полутора суток кислородом воздуха в присутствии меркаптоэтанола вряд ли отвечает условиям, требуемым для решения поставленной задачи [59]. Термодинамика процесса денатурации лизоцима, как и некоторых других белков, была детально охарактеризована П.Л. Приваловым [40].
В его работе с У. Пфейлем была обнаружена высокая чувствительность энтальпии и энтропии развертывания белковой цепи к температуре, что, согласно закону Кирхгофа, должно свидетельствовать о различии в теплоемкостях свернутого и развернутого состояний [100]. Это видно нз рис. П1.13, где представлены зависимости энтальпийных (Н') и энтропийных (ТБ') вкладов в свободную энергию свернутой и развернутой форм лизоцнма.
Более высокое значение теплоемкости развернутого состояния, по мнению Привалова, Пфейля и других исследователей [100-103], связано прежде всего с температурнозависимым упорядочением молекул воды вокруг неполярных остатков, более доступных в этом случае. На рис. 111.13 показаны также температурная зависимость свободной энергии Гиббса (б') двух состояний и температурная зависимость разности ЬО = = О,„,.р„— О'„„„,„„(Та, — температура плавления нативного лизоцима, при которой АО = О). 379 и ч р и зз ГР йп Ш Язх ГРВ ЗЗ ГР азу Язз и дтр -87 и лз ра ьв хп во и га езз а ж пп уймпезмптууза, 6 Р и с. П!,13. Термодинамические параметры свернутой и развернутой форм пизонима прн ры т,а и различных темперазурах !181 Большое изменение теплоемкости при развертывании белка обусловливает существование температуры, при которой стабильность свернутого состояния достигает максимума 140, 101, 1041.
Согласно результатам измерения свободной энергии это имеет место при ЛЗ' = О, а константы равновесия — при ЬН' = 0 [1051. В любом случае стабильность уменьшается при отклонении температуры в обе стороны. Следовательно, белки могут денатурировать прн двух критических температурах — более высокой от оптимального значения !Тм на рис. 111.13) и более низкой. Низкотемпературное развертывание имеет противоположные термодинамические характеристики по сравнению с высокотемпературными, за исключением изменения теплоемкости, но оно существенно не отличается (106-1081. Прочно укоренилось представление о том, что цистеинсодержащие белки являются наиболее удобными объектами исследования денатурации.
Действительно, для белков с дисульфидными связями разработан комплексный экспериментальный подход к изучению структурной самоорганизации полипептидной цепи. Он включает методы„позволяющие прекращать практически мгновенно процесс ренатурации белка в любой момент времени и фиксировать образовавшиеся к этому моменту дисульфидные связи и тиоловые группы, выделять в чистом виде промежуточные продукты на любой стадии ренатурации и определять в каждом продукте число Б — Б-связей н места их локализации в цепи. 380 На основе экспериментального поДхода, объединяющего отМ ° тмеченные выше и некоторые другие методы, можно проводить изу зученне денатурацни по строго логической и апробированной схеме. Она пр режде всего включает получение информации о наличии дисульфиднои с связи в любом промежуточном продукте, что свидетельствует о сближец йности соответствующих участков его полипептидной цепи.
Такие данн 'нные о серии продуктов, например о моно-Б-Б-производных, образовавш на первом этапе ренатурацни, создают о каждом из них специфич ф Ческое стереохимическое представление. Сопоставление таких (а им нн, детерминированных числом и положением дисульфидных свя, вязей) представлений о всей гамме метастабильных промелсуточных л)з, )зодуктов на пУти РенатУРаЦии от флУктУиРУющего клУбка до натн „,- нвной трехмерной структуры позволяет выделить ряд связанных между бсо ой продуктивных промежуточных состояний внутримолекулярньж к( р тируемых реорганизаций, ведущих этот ряд к нативной конфоры и ации. Дисульфидная связь как бы делает видимым весь процесс сб р, орки белковой глобулы.
В наиболее полной мере имеющиеся возмолсн ности реализованы пока лишь для одного белка — бычьего панкреатиче „о еского трипсинового ингибитора. Т. Крейтон, сравнивая изученный им механизм свертыва ия елковой цепи БПТИ с имеющимися данными по денатур цнн д белков, полагает, что трипсиновый ингибитор не является в,, отношении уникальным объектом [591.
Специфика его ренатурацнн н носит принципиального характера и легко объясняется мал лыми РазмеРами молекУлы, котоРые делают Укладку полипептидной ц „н более быстрой и прямолинейной по сравнению со сборкой простр „, венных структур высокомолекулярных белков. Он полагает ч о упаковка и развертка природной полимерной аминокислотной последн вательности описываетсЯ следУющей кинетической фоРмУлой, об ,о щей для всех белков: д~ п1 о2 — ь1 —: оа: — пь — '": — — пг - па я — пз Дз пз ПРомежУточные пРодУкты дм Дм Дз, б,, энергетически менее предпочтительные макросостоянию (), с кот „„„, тор ым они находятся в неустойчивом равновесии (напомним, что состояние 0 есть статистический клубок, т.е.
множество флу, ктуи- рующих конформаций белковой цепи). Промежуточные лродук ты и,, п2, пз, и." — аналогичные вариан'ь! по отноюению к строго детерминированной нативной конформации г), Согласно Крейтону состояниям дм дн.. и по пз... в той или иной мере присущи ч одного из предельных состояний (() или Х). Чем ближе положенн пРомежУточного пРодУкта к конечному продукту процесса денатур (Р) или ренатурации (Х), тем ближе данное микросостоянне „ соответствующему макросостоянию и, следовательно, болыпе ск< 38! взаимного перехода. Наиболее медленной стадией денатурации белка является превращение микросостояний, прн котором одно теряет последний признак нативной конформации, а другое приобретает первый признак статистического клубка (при ренатурации наоборот) Таким образом, по Крейтону, процесс свертывания белковой цепи заключается в постепенной потере промежуточными продуктамв свойств макросостояния Р н приобретении ими свойств макросостояния Х, т.е, в последовательном приближении к трехмерной структуре нативного белка.
Подробная трактовка белковой ренатурации и общее кинетическое уравнение полностью соответствуют двухфазной теории Брандтса и уравнению Р ~~ Х, в котором согласно теории Р и ]ч— макросостояния, включающие наборы микросостояний (см: например, рис. П1.1). Рассмотренные здесь экспериментальные данные о денатурации белков, в том числе БПТИ, однако, трудно согласовать с простым линейным механизмом процесса, отвечающим теории двух состояний Брандтса и общей кинетической формуле Крейтона. Наиболес убедительно об этом свидетельствует, прежде всего, несоответствие между экспериментальными результатами исследования Крейтона и его же кинетическим уравнением. которое не может описать реальный механизм свертывания и развертывания белковой цепи выбранного нами простейшего тест-объекта.
В самом деле, экспериментально и самим же Крейтоном доказано, что деназурация БПТИ ]п кнго представляет собой не прямолинейный, а разветвленный процесс, и поэтому свойства его метастабильных состояний не будут строго промежуточными между свойствами предшествующих и последующих состояний (см., например, рис. 111.8). Путь денатурации проходит через ряд промежуточных продуктов, которые не обладают чертами ни одного из своих макросостояний. С другой стороны, имеются промежуточные продукты, близкие по укладке цепи к одному из макросостояний, однако путь к нему проходит не через эти продукты, а через их конверсию в другие продукты, менее напоминающие пространственную форму данного макросостояния. Обнаружены многочисленные факты, касающиеся денатурации других белков, которые также ие отвечают строго последовательному н, казалось бы, наиболее простому пути укладки белковой цепи в нативную конформацию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
