Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 97
Текст из файла (страница 97)
Позднее зто бьшо подтверждено рядом исследований. Прн изучении свертывания рибонуклеазы большой интерес вызвал факт более бысгрой реставрации дисульфидных связей по сравнению с восстановлением ферментативной активности белка. Он был обнаружен Анфинсеном и соавт. [79[ в 1961 г. при окислении денатурированной рибонуклеазы кислородом воздуха и объяснен образованием неправильных 8 — Я-связей, которые со временем перераспределяются в правильные, что и лимитирует скорость укладки нативной конформации.
Этому объяснению, однако, противоречило более позднее наблюдение того же Анфинсена за скоростью восстановления активности белка, которая оказалась обратно пропорциональной его концентрации [801. Тогда было предположено образование денатурированными цепями рибонуклеазы межмолекулярных дисульфндных связей, которые со временем разрываются и переходят в правильные внутримолекулярные связи. Очевидно, что чем больше концентрация денатурированного белка, тем вероятнее ассоциация их молекул посредством 8-8-связей и медленнее восстановление активности.
Процесс окисления восстановленной рибонуклеазы кислородом воздуха оказался, таким образом, отягощенным побочными явлениями, не имеющими прямого отношения к механизму молекулярной реоксндацнн. Г. Шерага и соавт. [811, Д. Уетлауфер и соавт. [82] отказались от реокисления рибонуклеазы кислородом воздуха и использовали для образования 3-3-связей реакцию тиол-дисульфндного обмена с помощью глутатиона.
В обеих работах отмечено быстрое появление промежуточных продуктов с тремя Я вЂ” Я-связями, после которого наступали продолжительный период переориентации взаимодействующих остатков Суз и рост ферментативной активации. Авторами была принята точка зрения Анфинсена и соавт. [79[ относительно образовании на первом агапе реоксидации 'болыпого числа промежуточных продуктов с неправильными дисульфиднымн связями. Исследования Р. Болдвина и соавт. [561 и Т. Крейтона [83, 84| показали, что повторное свертывание рибонуклеазы с четырьмя правильными дисульфидными связями может происходить [п чйго быстро, если придерживаться условий, близких к условиям укладки белковой цепи БПТИ. Для интерпретации промежуточных состояний н определения скорости образования 8 — 8-связей ход процесса ренатурации рибонуклеазы, как и в случае БПТИ, блокировался на разных стадиях, выделялись промежуточные продукты и с помощью злектрофоретической подвижности они анализировались.
На начальном агапе сборки полипептидной цепи наблюдалась близкая аналогия в поведении рибонуклеазы и БПТИ. 11ри введении ПГГ! моно-$--5- продукты первого и второго белка образовывались примерно с одинаковой скоростью. Далее, однако, картина менялась: ди-8 — 8-продукты появлялись медленнее, а продукты с тремя и четырьмя дисульфидными связями вообще не обнаруживались. Все это наглядно иллюстрируется рис. 1!1.10, изображающим элезрофоретическое разделение промежуточных продуктов рибонуклеазы, блокированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б). Полосы (1) и (В) на рис, 111,10 отвечают состояниям с одной и двумя 8-8-связями. При обсуждении аналогичных данных по БПТИ отмечалось, что электрофоретическая подвижность продуктов, фиксированных йодацетамидом, определяется лишь формой молекул, В связи с этим отсутствие разрешения полосы Р на компоненты и наблюдающееся только ее расширение (рис.
Ш.10, и) свидетельствуют о близости конформацнонных состояний рибонуклеазы с одной и двумя Я вЂ” 8-связями к состоянию Р, т.е, к статистическому клубку. У молекул БПТИ, аминокислотная последовательность которой более чем в два раза короче последовательности рибонуклеазы, этого не происходит (рис.111.10, б); из рис. В1.10 видно, что заметное различие в конформационных состояниях белковой цепи имеет место даже среди отдельных моно-$ — 8-продуктов. Полученные Крейтоном результаты по ренатурацин рибонуклеазы с реагентом РТ Г! свидетельствуют о том, что через 30 мин после за- 3 пуска процесса в образующейся смеси накапливаются при частичном сохранении состояния Р только моно- и ди-8-8-продуктьп образование третьей дисульфидной связи в этих условиях не происходит 183, 85). Следовательно, экспериментальные данные по реокислению БПТИ н рибонуклеазы не согласуются с распространенным представлением о таком пути свертывания белка, при котором образование одной правильной дисульфидной связи автоматически приводит к сближенности остатков цистеина, образующих между собой следующую и также зн правильную дисульфидную связь и т.д., вплоть до конформации Мзн, близкой к нативной, в которой сближены последние свободные остатки Сух.
Более быстрое образование третьей и четвертой дисульфидных связей происходит при использовании в качестве днсульфидного реагента окисленного глутатиона (8 — 8-глутатиона). Однако, как видно из рис. 111.11, и в этом случае ренатурация не достигает состояния Х. Рибонуклеаза принимает полностью нативную конформацию после медленного внутрнмолекулярного перераспределения 8-Я-связей в три- 8-8-продуктах (111) н последующего тиолкатализируемого перераспределения тетра-8-8-продуктов (1Ч). Полупериоды конформационных переходов, завершающихся образованием промежуточных продуктов с одной (1), двумя (П), тремя (И1) и четырьмя (1Ч) дисульфидными связями, согласно Крейтону, равны 2 10 з, 3. 1О-з, 1 и 20 с соответственно 183-85).
Следовательно, образованные вначале у восстановленной рибонуклеазы дисульфидные связи не только не благоприятствуют образованию следующих, а, напротив,препятствуют этому. В процессе ренатурации БПТИ полупериоды накопления 375 Р и с. П1.10, Денситометрические крнлые электрофоретнческого разделения молекул, фиксированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) л процессе ренатурацнн паикреатической рибонуклеазы с использованием а качестве дисульфндного реагента дитиотреитола 1831 Р и с. 11!.11. Денситометрические криаые электрофоретического разделения молекул, фиксироаанных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) а процессе ренатурации панкреатической рибонуклеазы с использоаанием а качестае днсульфинногореагентаокислнтельного глутатиона(8 — Я-глутатион)183] промежутоных продуктов (!) и (П) имеют тот же порядок, что и у рибонуклеазы, а продукты с тремя 3-3-связями (!И) — 12 мкс.
Укладка белковой цепи БПТИ ]п уз(го, если судить по метастабильным промежуточным состояниям с дисульфиднымн связями, менее беспорядочна, чем у рибонуклеазы, поскольку моно-3-3-продукты у этого белка более компактны, а скорость образования продуктов с двумя дисульфидными связями больше, чем с одной. Энергетические барьеры укладки БПТИ. по-видимому, также ниже, так как ее ди-3-3-продукты быстро перехо- зп дят в конформацию ]ь]зн, близкую к нативной, а у рибонуклеазы время перегруппировки 3-3-связей более продолжительно и, кроме того, сам процесс затрагивает продукты, имеющие насыщенные системы дисульфидных связей. 376 Р и с.
Н1.12. Кннетика восстановления антнгенной активности рибонуклеазы в нроцессс ренатурацин Ио!олвзованы антитела, узлаынке участка: 1 — (1 — !З),2 (21 — 79), У (80 — !24) белказоа ВВ тлсбулы 186) в 1 Л. Чавец и Г. Шерага [8б) й ВУ предприняли попытку просле- Ъ дить за возникновением натив- й ВВ попс)добной конформации рибонуклеазы в процессе ее реоксндации на воздухе, воспользо- ~ ~ЫВ вавшись иммунохимическими методами. Они получили набор антител, узнающих в трехмерной структуре белка фрагмен- 2)(теми, лтитт ты 1-13, 31 — 79 и 80-124, и с их помощью исследовали кинетику восстановления антигенной активности по ходу ренатурации рибонуклеазы. Результаты, представленные на рис. Ш.12, показывают неизменное увеличение активности со временем, последовательность и постоянную направленность сборки трех выбранных фрагментов в сторону нативной конформации рибонуклеазы.
Л. Чавец и Г. Шерага пришли к заключению, не согласующемуся с данными Т. Крейтона по ренатурации рибонуклеазы и отчасти ВПТИ, проведенной, правда, в иных условиях. На основе результатов иммунохвмического анализа они представили механизм ренатурацни белка, исключающий образование промежуточных продуктов, прямо не приближающих свертывание полипептндной цепи к конечной физиологически активной трехмерной структуре.
По их мнению, процесс ренатурации рибонуклеазы представляет собой строго упорядоченное, последовательное формирование структурных элементов натнвной конформации белка. С. Шаффер [871, исследуя процесс ренатурации рибонуклеазы с помощью 8-8-глутатиона, обнаружил, что образование моно- н ди-Б— Я-продуктов практически не сказывается на кривых кругового дихроизма, при последующем появлении и накоплении продуктов с большим числом дисульфидных связей они приближаются к спектру нативного белка, В связи с тем, что в данном случае изменения в спектрах кругового днхроизма, как и в случае изменений поглощения и флуоресценции, отмеченных Р. Хантгеном и соавт. [8Ц, происходили раньше восстановления ферментативной активности рибонуклеазы, то, кан полагает Крейтон, они связаны главным образом с формированием у три- и тетра-Я-8-производных вторичных структур н гидрофобного окружения у ароматических остатков, а не с завершением образования нативной конформации.
С. Шаффер и соавт. [881 исследовали влияние среды на скорость свертывания белковой цепи рибонуклеазы с использованием окисленного и восстановленного глутатиона. Обнаружено, что действие нейтральных солей на скорость ренатурации 377 симбатно их стабилизирующему влиянию на свернутое.
состояние белка. Это позволило предположить, что в продуктивных промежу точных состояниях, последовательно переходящих по ходу ренатурации в нативную конформацию,,реализуются преимущественно те же взаимодействия, что и в конечной структуре. Выводы Чавеца и Шераги [86], как и Шаффера [87, 88), не согласуются с результатами и более поздних исследований Крейтона и соавторов рибонуклеазы А [89, 90) и рибонуклеазы Т1 [91] методами, использованными при изучении БПТИ. Здесь также обнаруживаются промежуточные 5-8-продукты, свидетельствующие о внутримолекулярной реорганизации дисульфидных связей по ходу ренатурации, такой же, как в случае трипсинового ингибитора. Не является в связи с этим неожиданным существование ферментов — дисульфидных изомераз, способствующих свертыванию БПТИ и быстрому образованию правильной системы дисульфидных связей [92, 93) [подробнее см.
гл, 14). 12.5. РЕНАТУРАЦИЯ ЛИЗОЦИМА Много работ посвящено изучению ренатурации лизоцима, начавшемуся на современном уровне с исследования К. Эпштейна и Р. Голдбергера [94). Однако и в них, как и в случае рибонуклеазы, нет досгаточной информации для однозначного ответа на вопрос об основных, принципиальных моментах механизма свертывания белковой цепи. Р. Брэдшоу и соавт.
[95), а позднее В. Саксена и Д. Уетлауфер [67] использовали для изучения обратимой денатурацни лизоцима реакцию тнол-дисульфидиого обмена; последние стали проводить ее с 8-5-глутатионом. В. Саксена и Д. Уетлауфер нашли, что сборка нативной конформации белка требует значительного количества восстановленного глутатиона, что является признаком образования промежуточных продуктов с неправильными, разрушаемыми на последующих стадиях ренатурации дисульфидными связями. Полупериод регенерации активного фермента сосгавил при оцтимальных условиях около 5 мин. С. Ристоу и Д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
