Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 96
Текст из файла (страница 96)
рассмотрение второго этапа также показало отсутствие этой связи в ди-Б-Б-производных. Неожиданно обнаруживается, что почти готовый продукт с двумя правильными связями из зрех оказывается наименее стабильным по сравнению с двумя другими ди-Б-Б-продуктами, имеющими только одну дисульфидную связь нативного белка (30 — 51). Взаимная конверсия ди-Б-Б-продуктов (30 — 51, 5-14) и (30 — 51, 5 — 38) происходит очень быстро или вообще не происходит.
Исследование этого вопроса усложнено быстрой конверсией обоих соединений в ди-Б— Б-промежуточное состояние (30 — 51, 5 — 55), включающее только нативные дисульфидные связи. Производные с двумя связями Б — Б зн восстанавливаются до моно-Б-Б-продуктов (при участии ВТТзн) со скоростью около 300 с ' моль-', т.е, на порядок больше скорости восстановления связи в модельных дисульфидах, что Крейтон объясняет наличием неболыпого конформационного напряжения белковой цепи.
Наиболее перспективным из метастабильных состояний с двумя дисульфидными связями, приближающими ренатурацию БПТИ к завершению, оказалось, таким образом, состояние (30 — 51, 5-55). Оно образуется не прямым путем, а благодаря внутримолекулярным перегруппировкам ди-Б-Б-производных (30-51, 5 — 14), (30-51, 5 — 38) и (30 — 51, 14 — 38) со скоростью около 0,4 с-' моль-', не зависящей от концентрации тиольного и дисульфидного реагентов. Продукт (30-51, 5-55) — это почти сформировавшаяся нативная трехмерная структура белка, в которой отсутсгвует лишь одна дисульфидная связь Суз-14- зн зн Суз-38 (Хзн).
О сходстве пространственной структуры Хзн нативной конформации Х! свидетельствует легкость образования недостающей 5 связи Б-Б, объясняющаяся сближенностью остатков Суз-14 и Сух-38 зн э (для превращения Хзн в Х ) требуется всего 10 мкс). Полная схема кинетического пути обратимой денатурации белковой цепи БПТИ, полученная в результате детальных исследований Крей- тона, представлена на рис. П1.8. Последовательность событий между двумя предельными термодинамически стабильными состояниями бел- 370 ~овей молекулы (от Р к Х), описанными через дисульфидсодержащие а етастабильные промежуточные состояния, изложена выше.
Обратный рроцесс (от Х к Р) может быть инициирован добавлением зн дитиотреитола в восстановленной форме (РТТзн). Он начинается с разрыва дисульфидной связи Суз-14 — Суз-38. Образовавшийся первый зн ~аегастабнльный продукт Хзн медленно, с периодом полураспада около зн 10ч, и независимо от концентРации РТТзн пеРеходит в ди-8-8- производные (30-51, 5-14) и (30 — 51, 5-38), которые трансформируются д монодисульфидные продукты, на первых порах преимущественно содержащие (30-51) и (5-30). Процесс деиатурации идет с деизмененным накоплением только состояния Р. Таким образом, схема развертывания белковой цепи является, по существу, зеркальным отражением схемы свертывания цепи.
Подбирая концентрации восстановленной и окисленной форм дитиотреитола, можно направлять процесс в ту или иную сторону и достигать или полностью развернутого состояния белковой цепи (Р), или нативной конформации белка (М 1) . Константа равновесия, пропорциональная относительному содержанию двух форм РТТ в третьей степени: И 0П 8Н 8 Ртт ) К=— М может быть найдена экспериментально по легко измеряемым 3 концентрациям [м1] и 1'Р). с другой стороны, эт> же константу можно получить, учитывая все промежуточные состояния в ходе денатурации или ренатурацин и соответствующие константы скоростей Моиформационных переходов н реакций тиол-дисульфидного обмена с помощью дитиотреитола. Совпадение константы равновесия, рассчитанной Крейтоном, исходя из определенного механизма свертывания и развертывания белковой цепи, с величиной, найденной им непосредственно из эксперимента, свидетельствует в пользу результирующей кинетические схемы (рис,1П.8), учитывающей правильно все этапы процесса и взаимоотношения между всеми промежуточными состояниями.
Равное содержание в растворе двух предельных структур белка, 3 5 г)1 и Р, получено при отношении РТТ/РТТ1, равном 1/2б. 3 5 Следовательно. средняя стабильность трех дисульфидных связей в 5 нативной конформации БПТИ составляет 0,1)4 стабильности РТТ1. (50 — 54. 5 — ~45 поег. 5-т е — зи ф =Й=Й 3. + зо 55 ап , ° зо Н5 51 Р и с. 1!1.8. Схема кинетического пути свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ (59! ЗО. Он 5 (зо ГЗО 5444 — ЗВ! Ри с.!!!.9. Изменение свободной энергии внутримолекулярньгх переходов в процессе свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ (приведены относительные значения свободной энергии исходного ((у), промежуточных И, Н, ХЦ) и 3 конечного ( н ) ) сосюяний) 3 Диаграмма (О) получена прп использовании набора «опсгапг скоростей пра отпоиеипп н Отт))У()П88Н = 26/!. а 3 диаграмма (б) — )О Л !59! 3 йаарйииата реакции— Кинетический путь укладки и развертки полипептидной цепи БПТИ в общем виде записывается, согласно Крейтону, следующей формулой: зн 8 ы д- (!) ( — ((!) 5- )'(зн (- где (!) и (П) — соответственно моно- и ди-о-э-промех(уточные продукты.
Для такого пути получен внутренне согласованный набор констант скоростей, в частности констант образования о-Я-связей (((,2), величины которых характеризуют относительную стабильность соответствующих продуктов. По этим данным, используя уравнение ЬС = — )оТ )и — ', !з)(г !(Т где й — универсальная газовая постоянная; Т вЂ” температура (в 372 где К вЂ” универсальная газовая постоянная; Т вЂ” температура (в абсолютной шкале); и — постоянная Планка; (с — постоянная Больцмана; й, — константа скорости реакции, можно рассчитать относительную свободную энергию Гиббса и, таким образом, воспроизвести энергетический профиль свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ (рис. П1.9).
Это было сделано Крейтоном для двух вариантов набора констант скоростей, один из которых получен при условии зн 3 1)ТТ ! !1ЛТан = 26, когда состояния 1) и Ж ! изоэнергетичны (рис. 111, 9, 3 3 з 3 «), а другой — при условии 13ТТ ! /1)Пан = 10з, когда (Ч ! стабильнее 13 Я 3 на б,2 ккал/моль (рис. Ш, 9, б). Последняя величина близка энергии стабилизации нативной конформации БПТИ, утрачиваемой в растворе с 8 М концентрацией мочевины.
Энергетический профиль ренатурации БПТИ (рис. Ш, 9, б) свидетельствует, во-первых, о кооперативности процесса, поскольку все промежуточные сосгояння с одной или двумя днсульфидными связями тер- 3 модинамически нестабильны относительно 1) и Х !, и, во-вторых, о Я сравнительно свободном кинетическом пути свертывания белковой цели 3 и, следовательно, большой вероятности нахождения состояния (9! в глобальном минимуме. Из последнего можно заключить о согласованности между термодинамикой и кинетикой процесса ренатурации. Установлением пути свертывания полипептидной цепи БПТИ еще не заканчивается изучение механизма обратимой денатурации белка.
Исследования Крейтона во многом помогли ответить на вопрос о том, как осуществляется процесс спонтанной структурной самоорганизации белка в условиях ш ч1гго. Так детально и аргументировано это было сделано впервые. Следующая задача заключается в том, чтобы понять полученные данные, т.е. ответить на вопрос, почему процесс сборки нативной конформации белка осуществляется именно таким, а не иным образом, в чем заключается физика явления обратимой денатурации, каково взаимоотношение процессов (п чйго и !и ч!чо.
Т. Крейтон уделяет внимание этому вопросу, однако его анализ имеет чисто описательный, феноменологический характер и качественно отличается от экспериментальной части его исследования. 12.4.РЕНАТУРАЦИЯРИБОНУКЛЕАЗЫ Наиболее интересно сопоставление результатов денатурации БПТИ, выбранного в качестве тест-объекта, с данными денатурации бычьей панкреатической рибонуклеазы — классического объекта, изученного также детально.
В отличие от БПТИ, здесь нет столь же полной информации о промежуточных продуктах и последовательности конформационных переходов от состояния 1) к М. Выше отмечалось, 373 что Анфинсеном была впервые показана, спонтанность процесса ренатурации рибонуклеазы, завершающегося образованием четырех днсульфидных связей нативной конформации белка и полным восстановлением ферментативной активности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
