Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 95
Текст из файла (страница 95)
25 мин интенсивность полосы П постепенно уменьшается, а полосы Х— увеличивается.На первой минуте ренатурации возникают и в течение 1[)-15 мин устанавливаются пики плотности промежуточных продуктов А. В и С. Близкое расположение пиков промежуточных продуктов друг к другу и к пику В свидетельствует, что они отвечают белковым молекулам, имеющим одну дисульфидную связь и отличающимся друг от друга формой. Этим же методом Крейтон [74[ при иных кинетических условиях ренатурации получил промежуточныс продукты с двумя днсульфидными связями.
Самого лу зшего разделения промежуточных состояний белковой цепи он достиг с помощью ионообменной хроматографии. используя блокировку йодацетатом. Разрешающая способность метода позволила одновременно наблюдать за кинстикой продуктов с одной и двумя дисульфидными связями.
Всего между пиками состояний П и Ч Крейтон обнаружил восемь ников метастабнльных состояний белковой 366 лг Р н с. П!. К денсвтометрнческне кривые алектрофоретпческого разделенна молекул, фиксированных йолацетамндома (а) н йоцацетатом (б) в процессе ренатурацнн восстановленного белка БПТИ [59) цепи БПТИ. Ионообменная хроматография была использована для выделения промежуточных продуктов и их разделения по числу дисульфидных связей. Идентификация самих же связей в последовательности БПТИ производилась после протеолитического расщепления белка на фрагменты методом диагонального электрофореза.
12.3. КИНЕТИЧЕСКИЙ ПУТЬ РЕНАТУРАЦИИ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ТРИПСИНОВОГО ИНГИБИТОРА После обнаружения целой гаммы промежуточных состояний на пути от полностью денатурированного белка к нативному Крейтон детально изучил'кинетику изменений и взаимопревращений этих состояний в ходе свертывания и развертывания белковой цепи. Далее он выяснил оптимальные условия моментальной остановки процесса ренатурации БПТИ и гашения тиол-дисульфидной реакции обмена, а затем разработал способы фиксации и выделения промежуточных состояний, определения у них количества дисульфидных связей и мест их локализации в аминокислотной последовательности БПТИ.
Таким образом, последующее изучсние денатурации белка, а именно получение количественных данных о кинетнке и термодинамике всех этапов процесса и доказательное описание механизма самоорганизации пространственной структуры белка!и Мго, имеет серьезную основу, созданную Крейтоном в результате огромной целенаправленной подготовительной работы.
Для выяснения пути перехода промежуточных продуктов друг в 367 друга путем образования, разрушения и перераспределения дисульфнд иых связей были использованы два линейных дисульфидных реагента (гидроксиэтнлдисульфид н окисленный глутатион) и один циклнческии реагент (дитиотреитол). Предварительно было выяснено, что разрушение трех дисульфидных связей БПТИ приводит к состоянию, в котором нативно подобные структурные элементы практически не обнаруживаются 175, 76).
Процесс ренатурации полностью восстановленной молекулы БПТИ (Р) начинается с образования начальной дисульфидной связи с линейными дисульфидными реагентами. Это происходит быстро и в строгом соответствии с реакцией второго порядка, что указывает на большую скорость внутримолекулярных переходов бс,з > 1 с '). В образовании первой Б-8-связи принимают участие все шесть остатков Суз, активность которых практически одинакова и близка к активности простых модельных тиолов.
Из 15 возможных промежуточных состояний с одной дисульфндной связью накапливаются только два независимо от времени ренатурацин, природы и концентрации дисульфидных реагентов. Один продукт с 5-Б-связью (30-51) неизменно составляет 60 — 70%, а другой — (5-30) — 20 — 30%; в минорную часть (менее 10%) входят продукты (5 — 51) и (30-55). Избирательность в накоплении монодисульфидных производных при первоначально эквивалентном состоянии всех остатков Суз и генерации беспорядочного набора моно-5-продуктов полностью денатурированным белком указывает на высокие скорости перераспределения взаимодействующих остатков Суа посредством тиол-дисульфидной реакции обмена.Нестатистичносгь обменов, т.е. наличие определенной направленности, обусловлена, по-вцдимому, меняющимися конформационными свойствами свертываемой полипептидной цепи. Переход беспорядочного спектра моно-$ — Я-продуктов, генерируемого гуаищщнгидрохлоридом, в упорядоченный совершается при доведении рН раствора до нормального значения (- 0,7) за несколько секунд.
Т. Крейтон показал, что после обработки денатурантом все 15 монодисульфидных продуктов присутствуют в растворе в равных концентрациях и, следовательно, изоэнергетичны. Улавливание их осуществляется переводом тиольиых групп в неактивную, незаряженную, форму подкислением среды. После удаления денатуранта при сохранении низкого значения рН связи 5-$ не остаются равными.
При повышении рН и переводе БН-групп в активную форму наступают избирательное перераспределение дисульфидных связей и накопление в растворе в основном только продуктов (30-51) и (5-30). Исключение составляет производное (5-55), которое не меняет своей позиции и не конвертирует в нормальные моно-Я-продукты (30-51 и 5-30). Оно не образуется в нормальных условиях ренатурацни и обнаруживается лишь с введением денатурирующего агента. Факт участия всех шести остатков Суз в образовании двух основных моно-Я вЂ” 5-продуктов был подтвержден Крейтоном при наблюдении закономерного падения скорости увеличения их концентрации прн последовательной необратимой блокировке остатков 14-38 и 5-55 белка в состоянии Р.
368 Скорость восстановления связи Б-Б нормальных моно-Б-Б-продуктов с зн -1, -1 «омощью 1)Пан равна 38 с ' моль, что совпадает с величиной, ожидаемой для модельного дисульфида. Предпочтительная аккумуляция наиболее сгабильного промежуточного состояния (30-51) имеет важные термодинамические и кинетические последствия, поскольку именно с этого состояния начинается путь продуктивного свертывания белковой цепи, и все последующие состояния содержат дисульфидную связь 30-51. В нативной конформации ВПТИ остаток Суз-30 находится в самом начале 9-складчатого листа (со стороны ])-изгиба), а Суз-51 принадлежит а-спирали.
Таким образом, Б — Б-связь образует мостик между двумя элементами вторичной структуры. Наличие а-спирали и 8-структуры в моно-Б-Б-продукте (ЗΠ— 51) было обнаружено с помощью спектров УФ, КД [64, 77] и ЯМР [65]. Не менее убедительные аргументы в пользу зарождения в самом начале процесса ренатурации вторичных структур получены также Т. Оасом и П, Кимом [78], обнаружившим их элементы в структуре соединенных дисульфидной связью двух пептидов из 16 н 14 остатков, последовательности которых воспроизводят порядки аминокислот БПТИ вблизи Суз-30 н Суз-51. Т.
Крейтон [18] полагает, что конформация моно-Б-Б-продукта (30-51), возникающая на ранней стадии процесса ренатурации и определяющая его последующий ход, стабилизируется за счет взаимодействий между двумя вторичными структурами, составляющими большую часть белка. Конформация, присутствующая в промежуточном продукте (30-51), не является доминирующей в индивидуальных модельных пептидах из 16 и 14 остатков в отсутствие Б-Б-связи [78]. Количество ее в полностью восстановленном белке оценивается около 0,1% [75]. Следовательно, утверждает Крейтон, значительная предпочтительность моно-Б-Б- продукта (30-51) относительно других промежуточных состояний объясняется не предсуществованием регулярных структур, а взаимной стабилизацией посредством дисульфидной связи. При дальнкчйшей сборке белковой цепи БПТИ и переходе монодисульфндных продуктов в дидисульфидные все промежуточные метастабильные продукты содержат, как отмечалось, связь Б-Б между остатками Суз-ЗО и Суз-51, и поэтому образование новой Б-Б-связн происходит через самый предпочтительный моно-Б-Б-продукт (30-51).
Скорость процесса, в котором принимают участие остатки Суз-5, Суз-14 и Суэ-38, пропорциональна концентрации дисульфидного реагента. В результате образуются продукты (30 — 51, 5 — 14), (30 — 51, 5-38) н (30-51, !4-38), причем последний содержит дисульфидные связи нативной конформации белка и более предпочтителен первым двум в отношении кинетики взаи- 3 модействия с ПТТ1. Связь Суз-5-Суз-55, которая также имеется в полностью собранной структуре БПТИ, не образуется. Разумноеобъяснение этому факту не найдено [18]. Причина, как полагает Крейтон, заключается в том, что при наличии в растворе днсульфида КБ-БК 369 остаток Суз-55 реагирует более эффективно не с каким-либо из свободных остатков Суз собственного белка, а с линейным дисульфидом, образуя быстро накапливающееся производное со смешанной дисульфидной связью (30-51, 55-БК) [59).
Относительные скорости внутримолекулярной конверсии ди-Б Б-продуктов (30 — 51, 5 — 14), (30 — 51, 5 — 38) и (30-51, 14 — 38) точно неизвестны. Однако можно полагать, что соединение (30 — 51, 14-38) переходит в два других заметно быстрее, чем обратно. Это уже третия факт, который на первый взгляд как будто бы противоречит кинетике самого быстрого прямого механизма свертывания белковой цепи. При исследовании первого этапа ренатурации были выяснены невозможность образования моно-Б-Б-производного с правильной дисульфидной связью Суз-5 — Суз-55 и се трансформации в другис дисульфидные связи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
