Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 94
Текст из файла (страница 94)
Первая стадия реакции — обычная реакция тиол-дисульфидного обмена, лишенная какой-либо белковой специфики. Вторая же стадия целиком зависит от сближенности соответствующих остатков Суз, т.е. от конформационных возможностей белковой цепи. Кинстика суммарной реакции зависит от относительных скоростей реакций обеих стадий. Прн благоприятном взаимном расположении остатков Сух или в случае более быстрого их сближения по сравнению с образованием промежуточного продукта скорость синтеза дисульфидной связи ограничивается первой стадией и будет пропорциональна концентрации вводимого днсульфидного реагента. При его большой концентрации и накоплении промежуточного продукта скорость суммарной реакции лимитируется второй стадией.
В случае медленного взаимодействия остатков Суз возникает конкурентная реакция с образованием ненужного продукта. Этого можно избежать, если использовать, по предложению У. Клсланда, нелинейный дисульфид, а циклический. напримердитиотреитол[РТ1)[68): сн, /~ носн з з носн ~/ В восстановленной форме дитиотреитол имеет линейную структуру: ~он,— зн носн ЗН 10ТТ ) НОСН ЗН ~он,— зн Его взаимодействия с белковой цепью описываются следующей схемой: ЗН зотт „ К, з зн а оП зн где К1 — константа равновесия смешанного дисульфида равна, согласно Клеланду, 10-4 моль-'.
Такое значение К, при обычных концентрациях 3 1)ТТ! исключает заметное накопление этого продукта. Б Скорость реакции мсжмолекулярного тиол-дисульфидного обмена, не отягощенного стерическими условиями, может быть оценена по зн скорости восстановления дисульфидов дитнотреитолом в форме 1ЛТзн. )зттззнн + КЗЗК вЂ” лайм ПТТзнзд — ~ — Р )Утт ~+ КЗП.
КБН Скорость реакции здесь лимитируется первой стадией. Реакция будет необратима, если не добавлять в раствор КЗН. Сульфгидрильзн ные группы ПТТзн имеют различные значения рК (8,3 и 9,5), поэтому при промежуточном значении рН раствора в ионной форме может находиться только одна группа. Значение константы реакции зависит от химической природы заместителей в дисульфиде КЯБК; его реакционная способность тем выше, чем электроположительнсе К, что естественно, поскольку тиольная группа активна в своей аннонной форме. Природа заместителя К отражается аналогичным образом и в 361 й,! Х! +ВТТ Я Ян 1 ! Бяптгян 1с+2 чн я 1~хн оказалась равной 38 с-' моль ', а кажущееся значение рК тнользн ных групп в Хзн — 8,8.
Зная рКкзн и ее зависимость от 1пК, находим константу скорости (гы, значение которой (28 с ' моль ') оказывается практически совпадающим с константами скоростей модельных соединений. Скорость образования дисульфидной связи Я Суз-14-Суз-38 с использованием 1ЛТ! пропорциональна концентрации Я реагента; при атом константа скорости реакции второго порядка равна 9,5 с ' моль-'. з пттзн ~~з 1с ! )с-2 При константе равновесия К~ = 10 ' моль ' — скорость внугримолекулярного перехода, Е„з должна быть приблизительно 10з с ', а соответствующий период полураспада т и-10 " с (значением (с,з определяется из условия чы = г, + ч+ь а 1с, — из формулы К! = Кддс,; малым значением й з пренебрегают). Относительная стабильность Я 3 дисульфидных связей в Х! и РТТ! находится нз соотношения 3 3 скоростей прямой и обратной реакции: (г = 9,5(38,0 = 0,25. способности к ионизации меркаптановой группы КЯН.
Чем больше парциальный положительный заряд К, тем меньше рКкзн и больше скорость обмена 1г„„„. Т. Крейтон установил линейную зависимость между логарифмом константы скорости второго порядка (1пК) и значением рКкзн, наклон которой, а следовательно, и активность Б-Я-связи и тиольной группы зависят от окружения [691. Как и следовало ожидать, при использовании в качестве денатуранта сильного злектролита— гуанидингидрохлорида (6 М раствор) — связь между 1пК н рКа „ ослабляется (прямая близка к параллельной оси абсцисс), а неэлектролита — мочевины (8 М раствор) — влияние почти не обнаруживается (прямая находится под углом 45' к оси абсцисс). Теперь на основе высказанных общих соображений рассмотрим конкретный пример разрушения и образования Б-Б-мостика между остатками Суз-14 и Суз-38 в нативной конформации БПТИ, воспользовавшись для иллюстрации количественными данными Крейтона !59].
Константа скорости реакции восстановления второго Я зн порядка нативного белка (Х !) с помощью П1'1зн 3 3 Таким образом, связь 8-8 в ПТТ! в четыре раза стабильнее связи 3 Суз-14-Суз-38 в нативной конформации молекулы БПТИ. При свертывании и развертывании белка может иметь место внутримолекулярная реакция тиол-дисульфидного обмена, сопровождающаяся соответствующим конформацнонным переходом; НЗ ЗН Наиболее стабильная геометрия дисульфидной связи отвечает двухгранному углу С-8-8-С (Хз з), равному +90'.
Все три 8-8-связи в нативной конформации БПТИ имеют )(з-з, близкий к оптимальному: -89Я (Суз-5-Суз-55), -102' (Суз-14 — Суз-38) и -88' (Суз-ЗО-Суз-51). Барьер вращения вокруг 8-8-связи составляет около 7,0 ккал/моль (Дж. Лове 1701; Р. Фразер и соавт. 1711; Н. Аллинжер и соавт. [721), что значительно ниже барьера на пути развертывания белковой цепи. Поэтому конформационные превращения, связанные с изменением геометрии дисульфидной группировки при денатурации белка, происходят сравнительно легко. Прн восстановлении и реокислении связей 8-8 с использованием реакции тиол-дисульфидного обмена можно манипулировать скоростями превращений в любых направлениях, меняя концентрацию тиольной н дисульфидной форм реагента.
Это имеет решающее значение не только прн изучении кинетики процесса денатурацни, но и для контроля энергии днсульфидных взаимодействий, что достигается путем изменения энергетического баланса между свернутой и развернутой формами белка. Кроме того, подбирая химическую структуру дисульфидного реагента под условия эксперимента, можно влиять на скорость дисульфндных взаимодействий вплоть до их прекращения у тех нли иных промежуточных состояний. 12.2. ФИКСАЦИЯ, БЛОКИРОВКА И РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ Тиол-дисульфидная реакция обмена, благодаря которой образуются, разрушаются и обмениваются остатками Суь дисульфидные связи, может быть быстро прекращена добавлением реагента, взаимодействующего со свободными сульфгидрнльными группами н тем самым блокирующего нх.
Чаще всего такими реагентами являются йодацетат и йодацетамид, реакция которых с тиолами проста и необратима, Согласно Кречтону (73), при РН 8,7 она протекает с константой скоросги второго порядка от 2 до 5 с-' моль ', так что при добавлении Н йг ЗХ НЗ 888 28 ЗЗЙ 28 (л ЯЗЗ ЗН гу ЗН Ф Р и с.!(!.5. Схема зкспери. ментального подхода к исследованию структуры про. межугочных состояний процесса свертывания белка с использованием днсульфнднык связей е — гипотетический путь свертывания полипептиднай Ле.
пн с шестью остатками цкс. теина; б — фиксированные промежуточные состояния,\П, г),(п,г(ч — времене блоки. раванил тиолдясульфлднага обмена соответственна у денатурированного белка (()). промежуточных пролуктов с адней (1) и двумя (Н) дисульфндными связями и у нвтивного белка(Х)(73! уп с. 1!1.6. Кинетика гипогетического пРоцесса свертывания белка с шестью остатками цнстеина Обсаначенн» см. Рнс. и!Л !73! 7ага7 ь н ту Л7 ~ Л~- вг .Узене еншееше в раствор одного из этих реагентов с концентрацией О,! М реакция тнол-днсульфидного обмена полностью гасится за несколько секунд.
3- $-связи, существовавшие до момента гашения, стабилизируются в отсутствие необходимого донора электронов, не обмениваются остатками Суз и не разрушаются. Таким образом, практически моментально по сравнению со скоростью медленной ренатурацни (десятки минут) останавливаются все процессы, связанные с взаимодействием боковых цепей остатков цистеина, фиксируются образовавшиеся до гашения дисульфидные связи и создаются идеальные условна для выделения и изучения содержащих эти связи промежуточных продуктов свертывания белковой цепи из полностью денатурированного состояния в Нативную конформацию. На рис. Ш.5 представлены основные этапы предполагаемого пути свертывания белковой цепи, содержащей шесть остатков Суа и имеющей в окончательной глобулярной структуре три дисульфидных мостика.
На рис. Ш.б приведены кинетические кривые денатурированного и нативного состояния белка и двух промежуточных метастабильнь!х состояний с одной н двумя дисульфидными связями. Эти кривые, также гипотетические, иллюстрируют кинетику изображенного на рнс. Ш.5 механизма укладки белковой цепи с точки зрении 3 — $-связей. Прн гашеави реакции тиол-днсульфидного обмена к моменту времени !о все молекулы белка будут стабилизированы в развернутой форме. К моменту !! нанболыпее количество молекул будет содержать одну дисульфид- ПУЮ СВЯЗЬ, а К !и — ДВЕ. СЛЕДОВатЕЛЬНО, ВРЕМЕНа 1! И 1п — НаИбОЛЕЕ ПОД- ходящие для прекращения взаимодействий остатков Суа и выделения пакопившихся промежуточных продуктов 1 и П.
Конформационный переход между двумя формами состояния П (на рис. П1.5 указан пунктирной стрелкой) совершается столь быстро, что не влияет на другие ароцессы. Возможность фиксировать и укладывать на разных этапах процесса свертывания белковой цепи промежуточные состояния с устойчивыми дисулнфиднымн связями делает реальным их выделение, очистку и всестороннее исследование структурных, термодинамических и кинетических характеристик. Промежуточные продукты отличаются друг от друга формой и молекулнрным объемом хотя бы в силу разного числа 365 дисульфидных связей, а также гетерогенностью, вносимой реагентом Х, реакцией гашения (блокировки).
Различие в конформационных свойствах и зарядах дает возмож ность эффективнее использовать для разделения фиксированных продуктов гель-злектрофорез, в особенности при малых значениях рН, когда становятся стабильными обусловленные кислотой промежу точные продукты. Молекулы БПТИ с полностью и частично восстановленными остатками Суз (состояния 1), 1 и П), блокированные йодацетатом, мигрируют к катоду медленнее по сравнению с молекулами в тех же состояниях, блокированными йодацетамидом или кис лотой, из-за соответственно шести, четырех и двух отрицательно заряженных ацетатных групп.
В свою очередь, молекулы в состояниях 1), 1 и 11 с нейтральными блок-группами ацетамида и кислоты имеют тот же заряд, что и молекула белка в нативном состоянии. Более медленная скорость их перемещения к катоду по сравнению с М обусловлена большей рыхлостью форм. Таким образом, скорость миграции белка, фиксированного йодацетатом, определяется как зарядом, так и формой, а белка, фиксированного йодацетамидом или кислотой, — только формой. Если предположить одинаковое конформационное влияние блокирующих реагентов йодацстата и йодацетамида, то форма белка будет коррелировать только с числом дисульфидных связей, которые при этом условии можно определить сравнением скоростей миграций одного и того же продукта, фиксированного как йодацетатом, так и йодацетамидом, со скоростью миграции белка в состояниях 1) илн Х.
Измеряя денситометром плотность в геле и наблюдая за се изменением во времени, можно составить представление о кинетике свертывания белковой цепи. На рис. 1П.7 приведены денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул БПТИ, блокированных йодацетамидом [а) и йодацетатом [б) в процессе медленной ренатурации. Сначала весь блок находился в состоянии О, которому отвечает в обоих случаях единственный резкий максимум плотности. При ренатурации и гашении реакции тиол-дисульфидного обмена через 1, 3.....
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
