Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 93

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 93)

Последующее изучение ренатурации рибонуклеазы А Дж. Гарелом и Р. Болдвином привело к еще одному неожиданному результату [54]. Оказалось, что как быстрая, так и медленная стадии этого процесса принадлежат нативной конформации белка, что никак не соответствовало посгадийной модели и механизму денатурации с Х-состоянием, промежуточным между Х и П. Позже Гарел и Болдвин пришли к заключению, что двухстадийная кинетика денатурации рибонуклеазы вызвана наличием в равновесии двух взаимно превращающихся состояний нссвернутого белка (П, н Пз), которые практически неразличимы для физико-химических методов [55, 561.

Относительное содержание В, и Пз не изменялось при варьировании концентрации гуанндингидрохлорида и значений рН раствора, что указывало на их принадлежность к предельно развернутому состоянию белковой цепи. Процесс денатурацин, по Гарелу н Болдвину, идет по формуле Х ~ Из ~~ В1 с быстрой стадией Х Ф~ Оз н медленной 0з ~~ 0ь Что жс собой могут представлять две полностью развернутые формы одного белка? Могут ли вообще отличаться флуктуирующие клубки одной и той же аминокислотной последовательности? Для положительного ответа на поставленные вопросы, по-видимому, существовал лишь один шанс и им воспользовались Брандте и соавт. [571.

Состояния П~ и Оз могут отличаться, оставаясь при этом статистическими образованиями, конфигурационной топологией полипептидной цепи, связанной с возможностью пептидной группы принимать транс- и цис-форму. В состоянии Вь как и в Х, все группы имск1т транс-конфигурацию, а в состоянии Р1 определенная часть пептидных групп находится в цис-конфигурации. Наиболее вероятна конфигурационная изомеризация у групп, соединяющих остаток пролина с предшествующим остатком.

356 Глава12 РЕНАТУРАЦИЯ ЦИСТЕИНСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ Логические и, как правило, фактические пути решения многих фундаментальных проблем, а также становление и развитие целых областей естественнонаучных знаний показывают, что почти всегда истоком и основой крупного научного достижения являются результаты исследования простейшего объекта, сфокусировавшего в себе самые важные и характерные черты рассматриваемого явления.

Вспомним, что становление подлинно научной генетики в значительной мере обязано выбору Г. Менделем объектом своего исследования гороха. Хорошо также известно, какой крупной удачей для развития биологии, прежде всего хромосомной теории наследственности Т, Моргана, учения Г. де Фриза о мутациях н обоснования генетических принципов эволюции, явился один только факт выбора в качестве объекта исследования плодовой мушки — дрозофилы. Не менее важную роль для становления и развития молекулярной биологии в целом и особенно молекулярной генетики, а в последнее десятилетие генетической инженерии сыграло использование фага штамма Е. со!Е А как обстоит дело с выбором объекта в изучении проблемы структурной организации белков и, в частности, в важной ее составной части — задаче свертывания и развертывания белковой цепи? Находится ли в центре болыпого количества работ в этой области изучение простейших белков, которое постоянно стимулирует и направляет исследования более сложных и определяет их возможности? Хотя среди множества изучаемых белков, безусловно, есть и простейшие, однако нельзя сказать, что они находятся в центре внимания, и решение структурных проблем белка, как и отдельных задач проблемы, сознательно строится по определенной программе.

С этих позиций и будут рассмотрены последующие работы по денатурации белков. Однако предварительно необходимо оговориться, что в данном случае следует понимать под простейшим, модельным объектом и каким требованиям он должен отвечать. Модельный белок, по-видимому, должен быть низкомолекулярным. Но не все белки с короткой цепью могут считаться простейшими, особенно в отношении их денатурационных свойств. Например, один из самых маленьких белков — инсулин — совсем не является простым и типичным и, согласно К.

Анфинсену и соавт. [581, прн разрушении дисульфидных связей не ренатурирует. Это связано с тем, что инсулин образуется путем протеолитического расщепления проинсулина и содержит две цепи. Следовательно, белок должен быть не только низкомолекулярным, но состоять из одной цепи. Желательно также, чтобы цепь свертывалась в глобулярную форму, представляющую собой один домен.

Структура белка, выбранного в качестве центрального объекта исследования явления денатурации, непременно должна содержать несколько дисульфидных связей. В настоящее время эти связи служат 357 Р и с. Н!Л. Трехмерная структура пеп- типного остова бычьего панкреатичес- кого трипсиноаого ингибитора если не единственным, то во всяком случае самым надежным источником структурной информации о промежуточных мета- стабильных состояниях. Кроме а того, возможность контролировать кинетику и термодинамику дисульфидного взаимодействия позволяет определить кинетические роли промежуточных состояний.

Знание внутримолекулярных преобразований соответствующих дисульфидных связей 26 дает представление о конфор- мационных переходах, ведущих зв к нативной структуре белка. Дисульфидные связи особенно полезны, когда белок денатурнрует прн их разрыве. В этом случае не требуются денатуранты и сохраняются все виды взаимодействий, определяющих стабилизацию белковой глобулы. Таким образом, типичный белок должен быть низкомолекулярным, состоять из одной цепи и иметь однодоменную, известную, с хорошим разрешением трехмерную структуру, содержащую дисульфидные связи.

Желательно, чтобы выбранный белок был простейшим и типичным при изучении нс только денатурацин, но и других свойств. Например, для выяснения принципов пространственной организации белков важны количественные оценки основных факторов стабилизации двух часто встречающихся регулярных форм пептидной цепи: а-спирали и р-структуры. Понимание структурной организации белковых молекул необходимо для последующиего изучения их биологического действия и установления связи между структурой и функцией.

Для обеспечения преемственности знаний важно, чтобы белок, выбранный в качестве простейшего для исследования структурной организации, оказался модельным и для исследования структурно-функциональной организации. Для этого он должен обладать простой и хорошо изученной экспериментально функцией. Отмеченным выше требованиям удовлетворяет бычий панкреатический трипсиновый ингнбитор (БИТИ).

Решающее значение в выборе этого белка как тест-объекта при рассмотрении денатурации и ряда других свойств сыграло то обстоятельство, что молекула БПТИ экспериментально и теоретически изучена более глубоко и всесторонне, чем многие другие белки. Не будет большим преувеличением сказать, что уровень исследования БПТИ во многом определяют экспериментальньге и теоретические возможности естествознания в изучении бел- ковых молекул. Что же касается денатурации, то предпринятое Крейтоном [59) еще в 1978 г. изучение механизма свертывания н развертывания полипептидной цепи БПТИ н сегодня опережает аналогичные работы по другим белкам. Аминокислотная последовательность БПТИ из 58 остатков была установлена Б. Касселсм и М, Ласковским [60); трехмерная структура белка с разрешением 1,9 А получена Р.

Хубером и соавт. [61) в 1974 г. и вскоре уточнена до 1,5 А Дж. Дайзенхофером и У. Стейгеманом [62). Белок включает шесть остатков Суз, которые образуют три дисульфидные связи: Суз-5-Суз-55, Суз-14-Сух-38 и Суз-ЗО-Суз-51. Схематически трехмерная модель пептидного остова молекулы БПТИ показана на рис. 1Д.4. Для поиска, фиксации и установления структуры промежуточных состояний, которые и определяют основные этапы пути укладки белковой цепи, исключительное значение, как уже подчеркивалось, имеют остатки цистеина, точнее, их способность обратимо и легко переходить в содержащий дисульфидную связь днмерный остаток цнстина. 12.1.

ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ В БЕЛКАХ Остатки цистеина и цистин легко переходят друг в друга по схеме; а н — н — ан н н СН + СН ~ СН СН + 2Н'+2в Г~ (-НН СО-) (-НН СО-) (-НН СО-) (-НЙ СО-) Превращение двух сульфгидрильных, нли тиольных, групп в дисульфидную представляет собой окислитсльно-восстановительную реакцию, чувствительную к присутствию в растворе акцептора (донора) электронов. Для кинетического изучения денатурации особенно важно то обстоятельство, что взаимодействия остатков Суз в белковой молекуле определяются не столько различиями в химических свойствах их сульфгидрильных групп (они, как правило, незначительны), сколько стереохимнческими факторами и конформационными возможностями полипептидной цепи.

Скорость образования 8 — 8-связи между любой парой остатков цистеина зависит исключительно от их взаимного расположения в пространстве и, следовательно, может являться количественной характеристикой вероятности соответствующих конформационных переходов. Идентификация дисульфидной связи ведет к обнаружению конформации, обеспечивающей ее образование.

Термодинамическое условие состоит в том, что конформационное состояние белковой цепи, стабилизирующее данную дисульфидную связь, должно в той же степени быть стабнлизировано наличием этой связи. Следовательно, конформационная основа механизма свертывания проявится благодаря конформациям промежуточных состояний, 359 обнаруживаемых через дисульфидные связи, конечно, при условии, что они останутся неизменными при такой процедуре [63-66).

Способ контролируемого образования Б-Б-связи, основанный на реакции тиол-дисульфидного обмена, был предложен в 1970 г. В. Саксеном и Д. Уетлауфером [67). Он связан с использованием дисульфндного реагента КзБЖз в щелочных условиях, когда тиольная группа находится в ионной форме (В,Б ) н чрезвычайно рва кционноспособна: В~Б + пгББиг < — В~ББВз + игБ . Образование по такому механизму дисульфидной связи между боковыми цепями остатков Суа в белке происходит в две стадии по следующей схеме: ЗЗИ я ВЗН я ЯЗН где 1с — константы скорости прямой [+) и обратной (-) реакций.

Характеристики

Список файлов книги