Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 92
Текст из файла (страница 92)
Более сложное кинетическое поведение белков при денатурации удалось наблюдать в'1971 г. А. Икая н К. Тэнфорду при изучении скорости свертывания и развертывания полипептидных цепей лизоцима и цнтохрома с с использованием техники стоп-флоу и УФ-спектроскопии 149). Полученные зависимости интенсивности поглощения (у) от времени для двух белков приведены на рис. 1113. Кривые прямого и обратного процессов у лизоцима (рис. Ш.З,а) симметричны относительно урмв и соответствуют приведенному выше уравнению реакции первого порядка. Кривые же цитохрома с (рнс. 1П.З,б) не отвечают теории двух- Р и с.
1П.З. Кривые реакции денатурацин н ренатурации лиэоцима (а) и цитохрома с (б) в 2,5 М растворе гуаниднэцидрохлорида, 25', рН 2,6 (а) и 6,5 (б) По орппнатам отложены коэффициенты экстннкцнн полос нагл оп(сни» ЗО! нм (а) н 400 нм (б) ллл нвтпвпых (ун) н лспвтурнрованпых (уо) сосммппа белков; параметр урвав отвечает условны рввнпвсспл Пап=! !49) ераВк еуаЬн. ереме фазного процесса и свидетельствуют о наличии в области перехода значительного количества помимо Х и Р еще одного состояния Х.
А. Икаи и К. Тэнфорд приходят к нетривиальному заключению и вводят понятие о таком промежуточном состоянии, которое, являясь частично свернутой формой, в то же время не может трансформироваться непосредственно в Х без предварительного развертывания. Иными словами, это состояние представляет собой "неправильно" свернутую конформацию белковой молекулы. Простейший механизм, отражающий такого рода взаимоотношения между состояниями белка в процессе его денатурации, может быть записан в виде Х ~У Р ~ Х. Согласно этой формуле первые шаги в свертывании полипептидной цепи, находящейся в состоянии статисгического клубка, должны быть строго обратимыми и не влиять на конечный результат.
Чем обусловлен такой непрямой путь свертывания белка в правильную нативную конформацию? По мнению авторов, он необходим ш уйго, поскольку в этих условиях процесс может начаться на любом участке несвернутой полипептндной цепи, в то время как !и у)уо он начинается со свертывания Х-концевой части (в предположении, что укладка белковой цепи в нативную конформацию происходит у Х-конца еще до окончания синтеза). Теперь можно сопоставить результаты термодинамического и кинетического исследования денатурации лизоцима и цитохрома с.
П.Л. Привалов и Н.Н. Хечинашвили не выявили различия в механизме свертывания и развертывания этих белков [39]. Наблюдая хорошее совпадение вант-гоффовской энтальпии и тепловых эффектов, авторы сделали заключение об одинаковом механизме денатурации лизоцима и цитохрома с и соответствии механизма модели двух состояний. Кинетическое исследование денатурации этих же белков Икаи и Тэнфордом с использованием гуанидингидрохлорида, независимо от отношения к трактовке авторов полученных данных, не дает оснований для такого вывода. Расхождение в термодинамической и кинетической оценках механизма денатурации цитохрома с тем более существенно, что,как было показано позднее Т. Тсонгом, этот белок даже в концентрированном растворе гуанидингидрохлорида не полностью денатурирован, 353 ! 2.
Проблема белка. т. 2 в то время как под действием температуры его денатурация идет до конца [50]. Тщательное параллельное изучение кинетических аспектов конформационных изменений и ферментативной активности при денатурации шести белков (фумаразы, энолазы, альдолазы, глицеральфосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогсназы) было предпринято в 1971 г. Дж. Тейпелем и Д.
Кошландом ]51]. Для каждого объекта исследовано влияние на кинетику свертывания фермента и восстановление его биологической функции наличия в растворе соответствующего субстрата или кофактора (Б), изменения ионной силы молекулы и концентрации. Заключения о конформационных изменениях делались по данным кривых дисперсии оптического вращения ферментов, показывающих характерный для них отрицательный эффект Коттона при 232 — 234 нм, и спектров флуоресценции в области 300— 400 нм.
Принципиальная схема повторного свертывания денатурированных белков ]п т)1го, к которой Тейпель и Кошланд пришли на основе собственных экспериментальных данных и анализа имеющегося в литературе материала, отвечает следующей формуле: 0~~Х,~н Эта формула сложнее формулы процесса денатурации цитохрома с по Икая и Тэнфорду (49].
Однако принципиальных противоречий между ними нет. Обе они не согласуются с теорией Брандтса, рассматривающей два состояния. Относительно быстрая реставрация структуры ферментов по сравнению с медленным восстановлением их биологической активности показывает, что промежуточные конформационныс состояния образуются в заметных концентрациях. Тот факт, что полученные на разных сгадиях ренатурации спектры ДОВ и спектры флуоресценции не имеют изосбестической точки, совпадающей с пересечением спектральных кривых состояний 1ч и 1), свидетельствует о том, что все промежуточные состояния одновременно присутствуют в растворе и находятся в равновесии.
Условия окружения, а именно: наличие или отсутствие специфических субстратов или кофакторов, их концентрация, значения рН раствора, ионной силы и концентрация белка, существенно влияют на скорость пространственной организации молекулы и на ее биологическую активность.
Анализ полученных данных привел авторов к выводу, что свертывание фумаразы. энолазы и альдолазы определяется прежде всего термодинамическими факторами, а у трех других белков существенно влияние также кинетических факторов. У предста- 354 вителя первой группы переходы между всеми промежуточными состояниями и обретение белком термодинамически самой стабильной трехмерной структуры достигаются значительно быстрее, чем у представителей второй группы.
В этом случае слабее кооперативность процесса структурной самоорганизации и путь к натнвной конформации более сложен и длителен. Дж. Тейпелем и Д. Кошландом было обнаружено, что скорость восстановления структуры белков 1п ч1гго больше скорости синтеза поли- пептидов 1п т1чо, включающего собственно химическую часть и укладку трехмерной структуры 1511. Биологическая активность при ренатурации восстанавливается значительно медленнее, чем при биосннтезе. Авторы предполагают, что свертывание 1п т1~о исключает образование предшественников, которые слишком медленно трансформируются в активный белок. Г.
Эпштейн и соавт. 152] исследовали кинетику свертывания кислой стафилококковой нуклеазы до нативного состояния путем нейтрализации в стоп-флоу спектрофотометре, измеряя флуоресценцию триптофановой боковой цепи. Общая кинетическая модель, к которой приходят авторы после анализа полученных данных, сводится к следующей формуле процесса денатурации: Измерения кинетики свертывания белка в интервале 13 — 38' позволили обнаружить протекание у него двух процессов, отличающихся друг от друга кинетическн и физически. Один из них, более быстрый, не подвержен в исследованной области заметному влиянию температуры, а другой, напротив, существенно зависит от нее. Первый процесс, происходящий в начале свертывания, авторы связывают с образованием зародышевых структурных форм, а следующий за ними процесс — с образованием гидрофобных областей и укладкой белковой цепи в компактную глобулярную форму.
Меньшая скорость второго процесса обусловлена большей высотой энтропийного барьера по сравнению с барьером на начальном этапе структурирования цепи. При исследовании термодинамики и кинетики денатурации рибонуклеазы А Т. Тсонг и соавт. 1531 столкнулись с парадоксальной ситуацией, впрочем, уже встречавшейся при изучении денатурации цитохрома с. С одной стороны, термодинамика свертывания белка в нейтральной среде показывает отклонение, а в кислой — близкое соответствие двухфазному процессу (М ~».— Р). С другой стороны, кинетика развертывания рибонуклеазы А в этих условиях свидетельствует об обратном. Попытка объяснить наблюдаемое несоответствие термодинамичсских и кинетических данных привела Тсонга и соавторов к разработке так называемой постадийной модели свертывания и развертывания белка, претендующей на обобщение известных фактов о денатурацни. 355 12* В предложенной модели чувствуется стремление авторов сохранить трактовку этих фактов с позиции теории двух состояний.
Развертывание нативной конформации белка, согласно постадийной модели, состоит из двух фаз: начальной и завершающей, которая, в свою очередь, может включать последовательный ряд стадий. Процесс деградации глобулярной нативной конформации до развернутой белковой цепи, на отдельных участках которой имеются зародышевые формы — элементарные структурные элементы белка, отнесен авторами к наиболее высококооперативным. Он проходит за период времени, на несколько порядков меньший по сравнению с последующим периодом разрушения зародышевых нуклеаций. Таким образом, процесс денатурации согласно Тсонгу и соавторам описывается формулой Х ~- Х ~с — О, причем стадия Х ~ Х является быстрой, а Х ~Ф [З вЂ” медленной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
