Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 91
Текст из файла (страница 91)
Денатурациоиная теория белков Брандтса, как отмечалось, основана на идее наличия двух состояний, каждое из которых представлено определенным распределением своих микросостояний. Теория позволяет предсказать свойства макросостояний в области перехода в предположении, что микросостояния, реализующиеся в этой области, не являются чем-то вновь созданным, а присутствуют в распределении Х н )з. В теории постулируется опподь не очевидное положение об отсутствии новых промежуточных конформационных состояний в области перехода. В связи с этим в каждом конкретном случае требуется критическое отношение к возможности описания процесса денатурации с помощью теории двух состояний. В общем случае, когда переход не отвечает схеме двух состояний, не должно быть совпадения значений изменения энтальпнн (сзН'), рассчитанной, согласно Вант-Гоффу, по температур- 349 ной зависимости константы равновесия двухстадийной реакции, истин.
ным калориметрическим тепловым эффектом денатурации (ЬН). О соответствии системы двухфазной концепции реальной ситуации может свидетельствовать форма кривых зависимости, например ЬН от температуры. Если система не отвечает теории Брандтса,то для кривых становится характерным наличие резко выраженного максимума в области перехода. Несмотря на то, что к началу 1970-х годов было уже проанализировано большое число реакций свертывания и развертывания белковой цепи с применением методов, основанных на теории Брандтса, тем не менее не удалось выработать определенного представления об общем для денатурации термодинамическом механизме процесса.
Наиболее трудным оказалось получить в каждом отдельном случае однозначные доказательства принадлежности процесса к действительно простому переходу между двумя состояниями, поскольку нельзя исключить возможность случайного соответствия опытных данных с теоретическими. Дж. Брандте считает, что имеется, по крайней мере, два примера, где соответствие схеме двух состояний продемонстрировано убедительно.
Один касается денатурацин миоглобина, а другой — рибонуклеазы. Исследование процесса свертывания цепи миоглобина Дж. Германсом н Г. Акампорой приводит к практически полному совпадению рассчитанных и опытных значений термодинамических параметров [38]. У рибонуклеазы совпадают величины ЬН' и ЬСр тепловой денатурации белка при 45', полученные прямым калориметрическим определением (86,0й4,0 ккал/молвя 2300х300 ккал/моль град) и расчетом с использованием данных УФ-спектров, основанным на идее двух состояний (89,0 ккал/молвд 2260 ккал/моль град). К заключению о правомерности использования модели двух состояний склоняют также данные прецизионных измерений П.Л. Привалова н Н.Н.
Хечинашвнлн тепловых эффектов (ЬН) тепловой дснатурации метмиоглобииа, а-химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима и цитохрома с [39]. Для этих белков отношение ЬН'/ЬН (ЬН' — зависящая от принятой модели вант-гоффовская энтальпня) равно 1,05й0,03, Отклонение весьма незначительно, и поэтому денатурацию пяти белков можно рассматривать в первом приближении как кооперативный переход между двумя количественно разными макроскопическими состояниями.
при котором промежуточные формы неустойчивы н присутствуют в незначительных количествах. Двухстадийный процесс денатурации, согласно П.Л. Привалову [40] и Т. Крейтону [18], обычно имеет место у однодоменных белков. Хотя многие данные о денатурапии различных белков как будто бы не противоречат теории Брандтса и модели двух состояний, тем не менее это приближение нельзя считать заведомо удовлетворительным при исследовании новых объектов. Нс следует также переоценивать значения совпадений экспериментальных и расчетных термодинамических параметров.
Нужно не забывать, что подход Брандтса является термодинамическим и, следовательно, феноменологическим н, как таковой, не может дать на основе статистических характеристик деталь- 350 ного описания конкретного механизма денатурации любого белка. Как отмечают Ламри и Билтонен: "Специальный подход с моделями, развитый Брандтсом, является не столько теорией, сколько полуэмпирнческим методом анализа изменений термодинамнческнх величин во время перехода между двумя состояниями (т.е, строго кооперативного) в белках" [20. С.
71], Известны случаи прямого, вполне очевидного несоответствия процесса денатурации двухстадийному приближению. Это проявляется, например, у карбоангидразы при ее денатурации гуанидннгндрохлоридом в различном характере экспериментальных кривых и типичных для двухстадийного процесса зависимостей [41]. У стафилококковой пенициллиназы отклонения от модели Брандтса обнаруживаются в несовпадении характера изменений при денатурации различных физических параметров. Так, если судить по вязкости и УФ-поглощению, белок совершает свой единственный конформационный переход и полностью денатурирует при 0,5 М гуанидннгидрохлорида, а согласно спектрам дисперсии оптического вращения (ДОВ), первые конформационные изменения происходят только при 1,5 М концентрации того же денатуранта.
Проводившие эти исследования Б. Робсон и Р. Пейн сделали вывод, что в интервале концентраций 0,5 — 1,5 М гуанидингидрохлорида в растворе существует в заметном голичестве третье промежуточное конформационное состояние белка[42]. Отклонение процесса денатурацин от схемы двух состояний может быть не только истинным, но и кажущимся, хотя сделать здесь однозначное отнесение не всегда представляется возможным. Если, например, конформация белка включает несколько доменов, то нх разверзьь ванне при денатурации может происходить последовательно, в значительной степени независимо и с разной скоростью. Денатурация мультисубъсдиничных белков, имеющих четвертичную структуру, обычно начинается с диссоцнацин н их последующего развертывания [43, 44].
Усложняют процесс денатурацин и затрудняют его интерпретацию также межмолекулярная ассоциация и выпадение в осадок развернутых белковых цепей, что часто происходит в слабоденатурирующей среде. В результате образуется третье состояние белка. Подобным образом ведут себя карбоангидраза и стафилококковая нуклеаза, развертывающиеся при малой концензрацин гуанидингидрохлорида и необратимо денатурирующие из-за малой растворимости в этих условиях.
Еще одна причина сложности процесса денатурации может заключаться в неоднородности молекулярной организации белка (в присутствии других белков или молекул в ассоциированном состоянии), которая имеет место илн с самого начала, или возникает в процессе развертывания. Известным примером такого рода является овальбумнн.
Сложный характер его перехода Х ~<.— 0 впервые был отмечен Р. Симпсоном и У. Козманом в 1953 г. и в течение более двадцати лет не мог быть объяснен [45]. Оказалось, что белок состоит из трех фракций, четко разделяемых электрофоретически, содержащих разное число (от 0 до 2) ковалентно связанных фосфатных групп. При исследовании фракций в 351 чистом виде отклонений от двухстадийного процесса не наблюдалось [46). Кинетические аспекты.
Трудно представить, что белки могут принимать натнвную физиологически активную конформацию, сворачиваясь случайным образом ло принципу "проб и ошибок". Даже в условиях ш хйго самопроизвольная сборка трехмерной структуры белка, не содержащего дисульфндных мостиков, происходит настолько быстро, что дает основание допустить во много раз большую скорость этого же процесса в условиях )п ч(чо по сравнению со скоростью рибосомального матричного синтеза аминокислотной последовательности. Создание за считанные секунды из развернутой полипсптидной цепи трехмерной структуры макромолекулы возможно только при высокой степени кооперативности процесса.
Естественно было ожидать, что кинетика этого процесса будет соответствовать такому механизму ренатурации белка, при котором происходящие на каждом участке последовательности события увеличивают вероятность и, следовательно, скорость последующей укладки всех отдельных участков цепи в направлении правильной натнвной конформации. Данному условию удовлетворяет самый простой механизм самоорганизации белков, включающий единственный переход между двумя состояниями (Х ~< — 1)). Согласно теории этого процесса, которая только что была рассмотрена, никакие другие состояния белковой цепи, кроме Х и 1), не присутствуют в экспериментально обнаруживаемых количествах в течение всего времени прямой (Х вЂ” > 0) и обратной (Х с — )з) реакций. Если развертывание и свертывание белковой цепи действительно следуют двухстадийному процессу, то изучение кинетики и выяснение деталей конкретного механизма денатурации и ренатурацни сталкивается с особенно серьезными трудностями.
Они вызваны большими скоростями реакции н малыми концентрациями промежуточных состояний, а это требует быстрореагирующей н высокочувствительной экспериментальной техники. Наиболее часто используются спектральные методы (ЯМР, КД, УФ), ферментативный гндролиз, иммунологические методы. Для быстрой остановки процесса применяются методы сгоп-флоу. В первых кинетических исследованиях денатурации белков в 1968 г. Ф. Поул 147) н К. Тэнфорд (23, 48) не обнаружили промежуточных продуктов; кинетнка процесса полностью отвечала переходу между двумя состояниями в соответствии с теорией Дж. Брандтса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
