Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 90
Текст из файла (страница 90)
Гвидта н С. Нильсена [25], в молекуле рибо- 345 нуклеазы А с восстановленными остатками цистеина совершается полный обмен всех обмениваемых протонов с той же скоростью, что и у модельных пептидных соединений. Исследования У. Харринггона, Дж Шеллмана, К. Тэнфорда и других показали. что и физические свойства белка с разрушенными дисульфидными связями отвечают свойствам статистического клубка; это подтверждается также тем фактом, что свойства не меняются при добавлении сильнейшего денатуранта-- гуанидингидрохлорида. Однако, как и во многих других случаях, в отношении белков рискованно делать слишком определенные и обобщающие заключения. Так, согласно данным Т.
Крейтона ~261, шесть сульфгидрильных групп восстановленных остатков Суз в панкреатическом трипсиновом ингибиторе обладают одинаковыми химическими свойствами и реагируют, например, с йодацетатом с той же скоростью, что и модельные меркаптаны. Таким образом, поведение денатурированного белка как будто бы аналогично поведению развернутой цели рибонуклеазы, тем не менее более тонкое исследование с использованием спектров ЯМР показало, что только разрывы дисульфидных связей трипсинового ингибитора недостаточны для его полной денатурации с исчезновением всех структурированных элементов нативной конформации или вновь образованных. Г. Снайдер и соавт.
[27], например, обнаружил у всех четырех остатков тирозина белка, лишенного дисульфидных связей, неэквивалентное окружение. Следовательно. трипсиновый ингибитор, денатурированный только путем восстановления атомов серы, не соответствует состоянию с полностью развернутой цепью и тем более состоянию статистического клубка. По спектрам ЯМР, реагирующим на развертывание цепи сужением линий протонного резонанса, было найдено, что денатурированный химотрипсиноген имеет значительно меньшую скорость катализируемого обмена протонов, чем малые молекулы, которые можно рассматривать как модель истинного полного развертывания. Наблюдение было объяснено неодинаковыми условиями проникновения обменивающихся атомов в места протонного обмена.
К. Тэнфорд утверждает, что только в очень концентрированных водных растворах гуанидиигидрохлорида полипептид действительно принимает состояние, определяющееся произвольным набором конформаций (23]. В любом случае вода является плохим растворителем для развернутого полнпептида. В этом состоянии аминокислотная последовательность легко осуществляет экспериментально обнаруживаемые внутримолекулярные взаимодействия, прежде всего, за счет дисперсионных контактов, а также электростатики и водородных связей. Конечно, такие взаимодействия не столь эффективны и менее стабильны по сравнению с нативным состоянием, но и здесь они создают плотную, постоянно мигрирую:цую сетку межостаточных взаимодействий. Для того чтобы клубок был действительно статистическим, нужно чтобы вращения вокруг ординарных связей основной и боковой цепей аминокислотной последовательности происходили независимо и в той же мере свободно, как у модельных малых молекул.
В свою очередь, это возможно только при условии одинаковой эффективности межмолс34б кулярных и внутримолекулярных взаимодействий и отсутствия избирательности во взаимодействии молекул растворителя с разнообразными по своей природе аминокислотными остатками. Очевидно, полностью удовлетворить подобным условиям (и, следовательно, привести белковую цепь в состояние истинного статистического клубка) не может ни одна среда.
Для оценки размеров конформационных изменений при денатурации белков наиболее удобной характеристикой является энтропия. Чем больше развернулась белковая цепь, чем резче переход порядок— беспорядок и чем ближе состояние цепи подошло к статистическому клубку, тем выше значение энтропии. В отношении этого фактора два рассматриваемых нами термодинамических состояния находятся как бы на разных полюсах. Однако в системе белок — среда возрастание конформационной энтропии при развертывании полипептидной цели в значительной степени компенсируется ее отрицательным изменением вследствие погружения неполярных атомных групп в воду (эффект гидрофобных взаимодействий).
Среднее изменение конформационной энтропии в расчете на один остаток при переходе из нативного состояния в денатурированное колеблется от 2 до 6 ккал/(моль град) [28 — 30]. По существу, эта величина составляет энтропийную стабилизацию развернутого состояния. Устойчивость компактной глобулы характеризует энтальпия. По данным С. Чотиа [12], среднее значение изменения энтальпии на один остаток при том же переходе составляет 2,5 — 3,0 ккал/моль. Для нативной конформации лизоцима была получена общая энергия сгабилизации 28 — 36 ккал/моль, причем наиболее существенный вклад (около половины) вносят гидрофобные взаимодействия. Разность свободной энергии между нативным состоянием и денатурированным, нли общая стабильность функционирующего в физиологических условиях белка, составляет, согласно К. Тэнфорду [31], К.
Пейсу [32] и П.Л. Привалову [33], от 4,0 до 15,0 ккал/моль. Это есть малая разность больших чисел. Р. Ламри и Р. Билтонен приводят следующие термодинамические характеристики устойчивости химотрипсина, которые авторы считают типичными для глобулярных белков [20]. Свободная энергия развертывания белка при рН 3,0 и 27' равна около 7,0 ккал/моль (при рН 7,0 равна 14,0 ккал/моль). Эта величина складывается из изменения энтальпии в 6,0 ккал/моль, которая включает изменение энергии внутримолекулярных ( — 183,0 ккал/моль) и межмолекулярных (123,0 ккал/моль) взаимодействий, и изменения энтропии в 170 ккал/ (моль град).
Энтропийный фактор (-ТЬЗ) также имеет два члена: конформационный, внутренний ( — 363 ккал/моль), и гидрофобный, внешний (320 ккал/моль). К. Пейс исследовал гидрохлорндгуанндиновую денатурацию у ряда белков при различных значениях рН [32]. На основе полученных данных автор рассчитал свободную энергию денатурацин, приведенную к нулевой концентрации денатуранта.
Найденная свободная энергия миоглобина (рН 6,0), миоцима (рН 2,9), а-химотрипсина (рН 4,3), рибонуклеазы (рН 6,6) и [3-лактоглобулина (рН 3,2) имела следующие 347 значения; 8,5; 9,5; 12,0; 16,0 и 22,0 ккал/моль соответственно. Приведенные белки, очевидно, не были отобраны в процессе эволюции по максимальной стабильности, поскольку реализация нх функций, как правило, требует определенной подвижности. Во всяком случае, синтетические белки, сконструированные эмпирически, обладают значительно болыпей стабильностью 134!.
11.2, МЕТАСТАБИЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ Выше были рассмотрены некоторые свойства двух предельных, термодинамически стабильных состояний природных аминокислотных последовательностей; нативного и полностью денатурированного. Оба конформационных состояния рассматривались независимо друг от друга; сравнивались лишь физические и химические свойства белковой цепи в различных состояниях. Теперь необходимо раскрыть связь между этими состояниями и понять те события, в которых участвует белковая цепь на пути от нативной трехмерной структуры к статистическому клубку нли в противоположном направлении, поскольку переход во многих случаях является обратимым (Х ~< — Р). В данном разделе обсуждаются главным образом экспериментальные исследования процесса денатурацни белков. Термодинамические аспекты.
Изучение денатурации привело в начале 1970-х годов к доказательству того, что сборка трехмерной структуры глобулярных белков представляет собой самопроизвольно протекающий, быстрый и безошибочный процесс. Утвердилось представление, что он термодинамически обратим, относится к переходам первого ряда и описывается равновесной термодинамикой и статистической физикой.
Нативное состояние белка имеет наименыпую свободную энергию Гиббса, т.е. является глобальным, в физиологических условиях,а термодинамически устойчивое состояние статистического клубка глобально в условиях полной денатурации. Первой теоретической трактовкой экспериментальных данных о денатурации белков явилась разработанная Дж. Брандтсом в 1964 г. термодинамическая теория двух состояний 135). Согласно этой теории, белковая молекула в растворе представлена целым рядом (в общем случае неограниченным) микросостояннй. Все онн входят в состав либо распределения Х (нативное макросостояние белка), либо Р 1денатурированное макросостояние). Состояния Х и Р характеризуются усредненным по всем макросостоянням параметром а, являющимся количественным выражением различных физических или химических свойств белка.
На рнс. 1П.! приведено графическое изображение процесса тепловой деиатурацнн белка, отвечающего переходу между двумя состояниями и, следовательно, описывающегося теорией Брандтса. Энергетическая шкала охватывает всю систему белок — растворитель. Теория Брандтса сделала возможным относительно простой термодинамический анализ конформационного перехода Х ~<- Р.
Используя экснс- ппжппги — риодтгии — т Координота )гио илии Р н с. П!Л. Графическое изображение процесса дснатурации белка Н и Π— термодинамические светонии» нвтнвного и денатурированного белка, определяемые равновесным распределением микроскопических состоянии )55) Р и с.Шли Изменение энтальпии (Н), энтропии (П) и свободной энергии Гиббса (б) в процессе развертывания белковой цепи химотрипсиногсна А [20) риментальные данные о переходе и трактуя их в свете теории двух состояний, можно построить диаграммы изменений свободной энергии, энтальпии и энтропии как функции координаты реакции. На рис. И1.2 приведена такая диаграмма для химотрипсиногена, построенная Р.
Ламрн н Р. Билтоненом 120) цо данным М. Айзенберга и Г. Шверта [36) н Дж. Брандтса 137). Из диаграммы следует, что в процессе денатурацин белка происходит монотонное изменение энтальпии и энтропии. В связи с тем, что только два макросостояния представлены большими популяциями на пути перехода от Х к Гз, то все промежуточные состояния должны обладать высокой свободной энергией Гиббса. В наличии одного знака и близких значений изменений г!гН и Т25Б Ламри и Билтонен видят характерную и существеннукз особенность структурной организации белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
