Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 75
Текст из файла (страница 75)
При использовании метода Монте-Карло отсутствуют объективные критерии отбора конформаций. Внушительное на первый взгляд коли. честно в 10 000 структурных вариантов может составлять лишь не. большую часть конформаций, подлежащих анализу. Наконец, как я а методах Левитта н Уоршела, Кунтца и соавторов, аппроксимация остатков сферами в методе Танаки и Шераги продиктована не фнзи ческими соображениями, а удобствами расчета. В модели никак не отражена конформационная специфика аминокислот.
В самом деле, трудно представить, как сферы могут передать конформационные свойства, например, вытянутых лабильных боковых цепей аргинина и лизина с их гидрофобными и полярными участками, имеющими четыре степени свободы ()(,— д4), или плоских боковых цепей триптофана и фенилаланина. Кроме того, потенциалы взаимодействий остатков вьь браны на основе незначительного экспериментального материала. В работе Д.
Габела и соавт. 1131), аналогичной только что рассмотренной работе С. Танаки и Г. Шераги, исходные коиформационные состояния аминокислотных остатков берутся уже не из эксперимента, а определяются на основе эмпирических корреляций. Для идентификации вторичных структур были использованы так называемые тетрапептидный и нонапептндный предсказательные алгоритмы, разработанные соответственно Льюисом и соавт.
!73) и Бэржесом и соавт. (1011. В данном случае эти алгоритмы, однако, привлекаются не к одной молекуле белка, а к серии родственных белков — 14 гомологам нейротоксина 11. Трехмерные структуры всех гомологов (точнее, геометрия основной цепи) считаются идентичными. Предварительные возможности такого подхода демонстрируются на 30 гомологичных последовательностях цитохрома с (104 остатка), пространственное строение которых полагается одинаковым и известным из эксперимента.
В связи с тем, что нонапептидная модель неприменима к четырем остаткам с Х- и С-концов белковой цепи, конформационное отнесение выполнено для 96-остатков. Вероятности реализации любого состояния каждого остатка в 30 гомологичных белках были усреднены. В результате из 96 остатков цитохрома с 43 отнесены к а-спиралям, вытянутой форме и 0-изгибам (для предсказания последних использован "тетрапептидный" алгоритм); для 53 остатков и восьми концевых конформационные состояния определены не были.
Из 43 идентифицированных остатков 33 отнесены правильно, а 1О неправильно. Такой же процедуре на первом этапе исследования нейротоксина В (метод включал всего девять этапов) были подвергнуты 14 гомологичных последовательностей этого белка. Остатки, которые по эмпирическим правилам имели вероятность образования определенной формы в 8 (и более) случаях из 14, идентифицировались однозначно, и им приписывались углы д, ф, отвечающие среднестатистическим опытным величинам в а-спирали, 8-структуре н Д-изгибе.
Из 57 рас- 292 кмотренных в каждой последовательности остатков 6 были отнесены да-спирали, 4 — к ]3-структуре и 16 — к ]3-изгибам. Здесь следует отметить два существенных, более того, решающих для данного исследования обстоятельства, на которых авторы не акцентируют внимания. Достоверность предсказательных алгоритмов, использованных в этой работе, как показывает опыт нх применения к 13 различным белкам известной стрктуры ]101], 30 — гомологичным белкам цито- хрома с и аденилаткиназе ]197], является незначительной, в связи с чем в отнесении 26 остатков нейротоксина 11 неминуемо содержатся ошибочные предсказания, которые ни на одном последующем этапе не обнаруживаются и, следовательно, входят в конечную структуру. Неоправданным является приписывание основным цепям идентифицированных остатков усредненных значений углов д, ф, полученных нз частот их появлений в низкоэнергетической области у известных белков.
Углы дз, ф обнаруживают в спиральной и особенно в]3-структурной области разброс в пределах многих десятков, а часто более сотни градусов. Конкретные значения углов д, ф в этих областях определяются не столько природой остатка, сколько уникальной для каждого белка последовательностью аминокислот, т.е. прежде всего взаимодействиями данного остатка с соседними по цепи и сближенными в глобуле остатками. Приписывание остаткам средних значений двухгранных углов в макромолекуле лишено практического смысла, поскольку последук>щая минимизация энергии не обеспечивает их правильный спуск, а лишь приводит к варьированию вблизи заданных значений.
Отмеченные два обстоятельства предопределяют конечный результат данного исследования и делают излишним рассмотрение других его восьми этапов, на которых также допускается целый ряд неконтролируемых предположений. Поэтому не удивительно, что ни один из пяти предложенных вариантов конформаций нейротоксина 11 не отвечает опытным данным даже самого общего характера.
В работах Д. Тзерноглон и А. Петско [198, 199] и Б. Лоу и соавт. (200] приведены результаты рентгеноструктурного анализа данного белка, которые свидетельствуют, что его третичная структура имеет форму диска; все же найденные Д. Габелом н соавт. ]131] структуры нейротоксина П обладают клубкообразной формой. В 1980-е годы исследования такого плана не претерпели существенных изменений и не внесли новых идей в решение проблемы свертывания белковой цепи. Для иллюстрации рассмотрим кратко результаты теоретического анализа процесса сборки полнпептидной цепи бычьего панкреатического трипсинового ингибнтора С. Миязавы н Р.
Джернигана ]201]. Белок изображался ими в виде цепочки жестких сфер, совмещенных с атомами С' н Св аминокислотных остатков. Конформацноннымн параметрами считались двухгранные углы у, ф, которым разрепилось принимать дискретные значения через каждые 10'. Межостаточные взаимодействия учитывались исключительно между теми парами остатков, которые в кристаллографической структуре бычьего панкреатического трипсннового ннгибитора (БИТИ) 293 образуют близкие контакты.
При оценке взаимодействия между двумя остатками свободная энергия принималась равной — 2,2 икал/моль, если расстояние меящу соответствующими атомами Са в нативной конформации белка находилось в интервале 2,4 — 6,5 А; когда оно было меньше 2,4 А, энергия считалась бесконечной, а больше 6,5 А — равной нулю.
Следовательно, притяжение друг к другу могли испытывать только те остатки (жесткие сферы), атомы СЯ которых сближены в реальной трехмерной структуре. Для беспорядочной генерации различных конформаций, располагающихся между нативным и денатурированным состояниями, использован метод Монте-Карло. Процесс модельной цепи оценивался по среднестатистическим величинам, отражающим степень упаковки цепи в различных местах шкалы конформационной энергии. Всего было получено 230 000 промежуточных состояний без атомных перекрываний.
Авторы проследили путь перехода модельной цепи от полностью развернутого состояния к состоянию, свернутому подобно нативной структуре белка. Согласно полученным данным, процесс свертывания начинается с образования нативно подобных контактов Са...Са в области 8-изгиба (остатки 25 — 28) н а-спирали (48 — 56) БПТИ. Их рост приводит к сближенности атомов С9 двух р-тяжей и созданию Д-структуры (14 — 38). Структурирование завершается образованием контактов между атомами С" Х- и С- концевых фрагментов.
Весь путь свертывания представляет собой непрерывную цепочку незначительно меняющихся в сторону нативной структуры конформационных состояний. Это не удивительно, поскольку авторы исключили все неспецифические межостаточные взаимодействия. Использованный подход в принципе не может привести к воспроизведению экспериментального механизма сборки белка, так как заведомо исключена возможность появления промежуточных конформационных состояний с признаками, отсутствующими в нативной структуре. В рассмотренных исследованиях по компьютерному воспроизведению свертывания белка используется, как уже отмечалось, сверх- упрощенное моделирование полипептидной цепи.
Неудовлетворительность подхода, однако, заключается отнюдь не в самом стремлении максимально упростить решаемую задачу, а в том, что этого стараются достичь за счет лишения исследуемого объекта всех специфических черт белковой молекулы. Рассчитываемые модели как в отношении своей геометрии, так и силового поля могут быть в равной мере отнесены практически ко всем линейным искусственным полимерам, причем и в данном случае они будут выглядеть упрощенными.
В подходе с упрощенными моделями используются методы минимизации энергии, которые исключают анализ значительных конформационных изменений и болыпих энергетических флуктуаций, что делает невозможным поиск специфических межостаточных взаимодействий, формирующих компактную глобулу. Состоятельное с физической точки зрения компьютерное воспроизведение процесса спонтанной самоорганизации трехмерной структуры белка требует не только 294 расчетной модели, в которой учитывались бы особенности природной гетерогенной аминокислотной последовательности, но н такого способа оценки конформационной энергии свертываемой цепи, в которой допускалась бы дифференциация специфических и неспецифических остаток-остаточных взаимодействий.
Предложенные модели и используемые методы минимизации энергии не удовлетворяют обоим требованиям. Поэтому для получения разумных результатов во всех работах пришлось отказаться от априорности расчета и прибегнуть к искусственному приему, а именно к выбору в качестве исходных для минимизации энергии приближений структурных вариантов, включающих важнейшие элементы опытной нативиой конформации белка, или использовать для той же цели эмпирические корреляции. Уменьшение таким путем количества неспецифических взаимодействий привело, однако, к фактическому отказу от независимого описания всего пути свертывания белковой цепи.
Решение задачи приобрело чисто формальный характер и свелось к рассмотрению только завершающей стадии процесса. Среди работ рассматриваемого направления лишь в исследовании Танаки и Шерагн сделана попытка создать общий метод количественной оценки энергии образования контактов между остатками и подойти к целенаправленному выделению наиболее актуальных для свертывания белковой цепи межостаточных взаимодействий [1561. По частотам контактов между 20 природными аминокислотами, реализуемых в кристаллографических структурах 25 белков, авторы рассчитали константы равновесия, а по ним нашли значения свободной энергии образования контактов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
