Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 50
Текст из файла (страница 50)
В случае ацетилхолинового рецептора правомерность построения моделей пространственной структуры на основе электронно-микроскопических проекций была 207 Р и с, Ь76. Структура криссалла белка Ха-канала в проекциях на плоскости а — си К ох б — (о, К и подтверждена результатами изучения структуры этого белка в форме двухмерных кристаллов ~б21]. Не исключено, что сходство пространственной организации этих белков обусловлено близостью их первичных структур. Первичная структура белков натриевого канала из мозга крыс в настоящее время не установлена. Однако известна аминокислотная последовательность белка, ответственного за формирование натриевого канала в электроплаксах угря. Результаты сравнительного анализа этого белка и холинорецептора из Нес~горпоспя 208 Р и с.
И7. Модель пространственной структуры Ха-канала, построеннан на основе проекций,приведенных на рис. 1.75 Р н с. 1.78. Модель пространственной структуры ацетилхолиновою рецептора е!ес1пспз демонстрируют высокий уровень гомологии их первичной структуры. Полученные данные, а также близость пространственных структур двух транспортных систем позволяют сделать предположение о существовании общих принципов структурной организации ионных каналов в мембранах.
Для многих белков число ориентаций их молекул на пленке †подложке велико. Поэтому на начальном этапе обработки приходится проводить кластерный анализ нх изображений. Методы кластеризации изображений также основываются на корреляционном анализе, однако не предполагают выбора каких-то из них в качестве моделей. Напротив, здесь каждое изображение на определенном этапе является "моделью" и сравнивается со всеми остальными — задача чрезвычайно трудоемкая, требующая для решения попарного сравнения всех изображений.
Более экономный способ кластеризации состоит в сравнении всех изображений лишь с несколькими из ннх, выбранными в качестве "09 Р и с. Ь79. Классификационная карта 48 изображений солюбнлизироваииой кальмодулии-чувствительной аденилатцнклазы относительно трех базисных векторов (изображений) Анализируемые изображсни» представлены нв карте своимн порядковыми номерами, указывающими располо жеиме соответствующик им векторов в трехмерном прпстранстве; изображения,группирующиеск в отдельные классы, обведены сплошными замкнутыми линиими т27 ~П й22 йУ 1И Абдтуусру 1 147с7 й22 Ю гу22 1Ю ы Ятгтл,р1 модельных. Количество таких моделей, достаточное для классификации, зависит от структурных особенностей объекта и определяется экспериментально.
Суть метода состоит в том, что существует возможность представления каждого изображения в виде вектора в некотором многомерном пространстве. При этом поиск одинаковых изображений сводится к отбору векторов, углы между которыми малы. Результаты такого исследования можно представить как распределение точек на семейсгве плоскостей, рассекающих многомерное пространство (рис. 1.79). Координаты задаются векторами, эквивалентными модельным изображениям, а точки определяют положение концов векторов анализируемых изображений. При таком представлении изображения, принадлежащие к одному классу (точнее, концы их векторов), должны располагаться в одной замкнутой области 2!О Р и с.!.80. Проекционная структура кальыодулин-чувствительиои адеиилатциклазы а — е.с — нроскиии, нолученныс усроднсннсм нзгзбраменид, еринадлеиащих одному классу на классификационных каргах )рггс. 1.798 гя — проекции.
выяааениьы гралинионнымн меголамн кросскоррелилиониого анализа многомерного пространства или, что то же самое, располагаться вместе при переходе от одной плоскости к другой. С использованием этого метода была исследована проекционная структура кальмодулин-чувствительной аденилатциклазы мозга [618, 6221. Этот фермент является ключевым компонентом системы гормональной регуляции, ответственным за трансмембранную передачу химических сипуалов, Молекулярная масса образующей его полипептидной цепи составляет 160 кДа. Ферментативная активность может возрастать в сотни раз в присутствии кальмодулина. Исследование проекционной структуры кальмодулин-активируемой аденилатциклазы было проведено как для солюбилизированных препаратов белка, так и после его реконструкции в липидные мембраны. При негативном контрастировании таких мембран кальмодулин-активируемая аденилатциклаза выявляется в виде частиц на поверхности мембран со средним диаметром 70+7 А.
Прн исследовании солюбилизированных препаратов белка, где число возможных ориентаций молекул велико, проводили предварительную классификацию изображений методом, описанным выше. На рис. 1.79 представлены результаты подобной классификации 48 изображений кальмодулин-чувствительной аденилатциклазы мозга быка. Использование трех моделей для классификации позволило выделить шесть классов изображений. Увеличение числа моделей н этом случае не привело к появлению новых классов изображений. Усредненные проекционные карты приведены на рис. 1.80.
Две из них соответствуют мембранным проекциям, выявленным при изучении протеолипосом (рис. 1.80, а,б[. Одна из проекций (рис. 1.80, «) иулссг аытянутун) форму с максимальным раза)ором 97 Л. 211 В то же время оценка высоты молекулы, сделанная на основе ее молекулярной массы и основных размеров мембранных проекций, дает величину около 100 А, что позволяет предположить, что именно она является одной из боковых проекций аденилатциклазы. Размеры остальных частиц, представленных на рис. 1.80, в-г, лежат в диапазоне 70 — 80 А и, по-видимому, являются наклонными проекциями молекулы.
Высота молекулы, определяемая по ее боковой проекции, значительно превосходит обычную толщину липидного бислоя и свидетельствует о том, что ее мембранный фрагмент относительно невелик. Это хорошо согласуется с данными по измерению парциальных объемов связывающихся с белком детергентов, которые показывают, что гидрофобная область молекулы мала по сравнению с ее гндрофильными частями [6231.
Прямых экспериментальных данных, однозначно указывающих на локализацию гидрофобного сегмента молекулы, в настоящее время нет. Однако сходство проекционных структур аденилатциклазы, белка иатриевого канала и холинорецептора позволяет заключить, что внутримембранный фрагмент молекулы аденилатциклазы локализован в средней ее части и значительныс по размеру участки полипептидной цепи экспонированы на обеих мембранных поверхностях. Изучение проекционной структуры молекулы является лишь первой частью структурного исследования.
Его результаты важны не только для последующей работы, но имеют самостоятельное значение. Достоверное выявление основных проекций зачастую позволяет исследователю уже на этом этапе составить представление о главных особенностях структурной организации молекулы. Очевидно, однако, что наиболее информативной будет реконструкция пространственной структуры. Существует несколько методов такой реконструкции.
Выбор конкретного метода зависит от специфики объекта, геометрии электронно-микроскопической съемки, количества проекций и т.п. Рассмотрим общий принцип наиболее простой реконструкции на основе моноаксиальных проекционных данных, т.е. проекций, получаемых при наклоне объекта относительно одной оси. В этом случае трехмерную реконструкцию можно свести к серии двухмерных реконструкций, Трехмерный массив — тело реконструкции разбивается на ряд сечений вдоль оси наклона, которые реконструируются одно за другим на основе соответствующих наклонных проекций.
Такой метод широко распространен в электронной микроскопии биологических объектов, так как он хорошо обобщается для любых ориентаций объектов, относительно быстр и не требует больших ресурсов памяти ЭВМ. На рис. 1.81 представлены две полученные этим методом модели структуры кальмодулин-чувствительной аденилатциклазы мозга быка [624[. В основу реконструкции положены единичные наклонные серии изображений двух молекул фермента.
"Нулевые" проекции молекул близки к приведенным на рнс. 1.80, а,в и сильно отличаются друг от друга, поскольку молекулы имеют различную ориентацию относительно пленки-подложки. Тем не менее, как видно на рис. 1.81. обе модели имекгг одинаковые размеры и схожи по форме. 212 Р и с. г.ах Моделе трехмерной структуры аденилатциклазы, синтезированные по наклонным изображениям двух частиц Такие единичные реконструкции позволяют выявить лишь самые общие особенности структурной организации. Для получения статистически достоверной модели структуры необходимо сделать ряд подобных реконструкций и провести их усреднение.
Одна трехмерная реконструкция дает статистически достоверную модель, если она производится на основе усредненных проекций. Однако в данном случае необходимо с помощью развивающихся в настоящее время методов классификации изображений отобрать гомологичные проекции для усреднения. Достаточно сложной является также задача определения относительных "углов наклона" различных проекций. Это обусловливает более высокукз трудоемкость исследования одиночных молекул по сравнению с двухмерными кристаллами. В то же время современные темпы развития методов исследования непериодических образований позволяют надеяться, что в недалеком будущем эффективности обоих подходов сравняются.
Во многих случаях электронная микроскопия является единственным "прямым" методолз изучения пространственной структуры. Это особенно очевидно при исследовании молекулярных комплексов, таких, как рибосомы или мультиферментные мембранные комплексы типа цитохром-с-оксидазы или Нч -АТРазы мембран митохондрий. Как уже отмечалось выше, наиболее информатинно изучение об.ьектои, имекзщих упорядоченнунз структуру. Иногда упорядоченность надмолскулярной структуры присуща объекту исследования!и у1уо, например некоторым вирусам или клеточным органеллам. В редких случаях белки функционирукзт в биологических мембранах в виде двухмерных кристаллов (бактсриородопсинд Обычно белок сначала необходимо выделить из клетки, очистить до гомогенного состояния и, используя специальныс методы, сформировать из него улорядочсннукз огруктуру: 213 двухмерный кристалл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
