Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Их использование для исследования кристаллов бактериородопсина дало возможность собрать экспериментальныс данные до разрешения 3 А в плоскости, параллельной мембране 16161. И хотя в направлении, нормальном к этой плоскости, разрешение оказалось значительно хуже, реконструкция трехмерной структуры позволила выявить ряд тонких деталей структуры, таких, как локализация боковых цепей некоторых аминокислот и р-иононового кольца ретиналя. Используя полученные данные как реперные точки и сведения о первичной структуре, удалось вписать полипептидную цепь в трехмерную карту белковой плотности и рассчитать атомную модель структуры белка.
6.3. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НЕПЕРИОДИЧЕСКИХСТРУКТУР К настоящему времени заметное развитие получила группа методов цифрового процессинга изображений непериодических объектов, позволяющих исследовать пространственную структуру отдельных макромолекул нли их комплексов. Как и в случае двухмерных кристаллов, пространственная структура непериодических объектов рассчитывается на основе параметров набора нх наклонных проекций. Однако в данном случае для получения статистически достоверной модели пространственной структуры необходимо усредннть большое число исходных проекций или индивидуальных трехмерных синтезов. В принципе можно использовать два подхода. Первый из них состоит в съемке наклонных изображений отдельных выбранных частиц и последук>щем синтезе их трехмерных структур, усредняемых затем между собой. Второй подход основан на анализе изображений всех частиц на пленке- подложке.
Благодаря неупорядоченной ориентации частиц при адсорбции на пленку-подложку их изображения представляют различные проекции одной структуры, т.е, являются "наклонными" относительно друг друга. Провсдя сортировку изображений, усредняют одинаковые проекции н сформнровывают нз них "наклонную серию", описывающую пространственную структуру объекта. Если число проанализнрованных 203 проекций велико, трехмерный синтез дает уже статистически усредненную структуру белка. Первым и чрезвычайно важным этапом работы является исследование проекционной структуры молекул. Именно особенности проекционной структуры позволяют выбрать дальнейшую стратегию изучения пространственной структуры объекта.
Задача исследования проекционной структуры состоит в выборе типичных для данного объекта проекций, установлении их характерных размеров, формы и т.п. и, наконец, в получении проекционных карт, характеризующихся определенным разрешением. Для решения этой задачи необходимо прежде всего получить высококачественные изображения объекта. В настоящее время электронная микроскопия одиночных молекул и их ансамблей практически полностью основывается на методе негативного контрастирования.
Разрешение изображений негативно-контрастированных препаратов не превышает 15 — 20 А. Поэтому целесообразно на одном из первых этапов цифровой обработки изображений провести их фильтрацию от шумов, обусловленных контрастированием. Отсутствие периодичности в изображении делает невозможным Фурье-фильтрацию, применяемую в случае двухмерных кристаллов.
При фильтрации непериодического изображения его Фурье-трансформаиту умножают на так называемую фильтрующую функцию. Чаще всего используется двухмерная функция распределения Гаусса. Такая математическая операция позволяет плавно удалить из трансформанты коэффициенты Фурье, генерированные деталями изображения, размер которых меньше предельного разрешения. Поэтому профильтрованное изображение, полученное преобразованием Фурье его трансформанты, обычно характеризуется более высоким соотношением полезный сигнал/шум, что облегчает последующие стадии цифровой обработки. Следующий этап работы состоит в классификации изображений, т.е.
выявлении одинаковых 1или очень сходных) изображений и объединении их в группы для усреднения. Классификазшя предполагает сравнение изображений для определения их соответствия друг другу. Объективной мерой соответствия двух изображений может служить их кросс-корреляционная функция.
Поэтому корреляционный анализ является традиционным методом исследования изображений. Простейшим наглядным примером могут служить два одинаковых произвольных изображения, повернутых на разные углы относительно их центров. Совместив центры изображений и поворачивая одно из них относительно другого, рассчитывают зависимость коэффициента их кросс-корреляции от угла поворота. Изображения на рис. 1.72 таковы, что при повороте на каждые 90' они будут полностью совмещаться и коэффициенты кросс-корреляции будут иметь максимальное значение, т.е.' равняться единице.
На реальных микрофотографиях изображения никогда не бывают полностью одинаковыми, и эти коэффициенты всегда меньше единицы. Проводя корреляционный анализ, изображения можно не только вращать, но и сдвигать относительно друг друга 1рис. 1.73), Величины коэффициентов корреляции в максимумах функции служат качественной мерой схожести изображения, а углы пово- 204 уууа бба р буа уууа Р и с. 1.72. Зависимость коэффициента кросс-корреляций К изображений 31 и 52 от угла поворота одного из них относительно друюю Р и с.
1.73. Экспериментальный пример кросс-корреляционного анализа двух зщептнчных юображеиий (круглые отасрстзщ) в — две одинаковые непрозрачные "маски" с круглыми отверстиями помещают в пучок света и Сдвигают в разлпчныс положения относительно друг друга; мерой позиционной корреляция является интенсивность света, проходящего через заштрихованную область; б — трехмерная диаграмма зависимости интенсивности проходящего света от величины сдвига верхней "маскнц максимум наблюдается при пплном совмещении краев обоих отверстий рота или сдвиги определяют взаимную ориентацию, в которой соответствие изображений максимально. Традиционная стратегия корреляционного анализа электронно-микроскопических изображений основана на выборе нз экспериментального набора профильтрованных изображений одного в качестве модельной проекции.
По этой модели проводится ориентация остальных изображений и усреднение тех из них, максимальные коэффициенты корреляции которых с моделью достаточно высоки. Усредненную проекцию можно принять за новую модель н весь цикл анализа повторить заново. Описанная стратегия анализа эффективна в тех случаях, когда в силу особенностей структуры объекта количество возможных его ориентаций на пленке-подложке мало н соответствующие им изображения хорошо различимы визуально на микрофотографиях. Далее, используя ограниченное число визуально выбранных моделей, легко классифицируют все изображения и получают проекционную структуру объекта, усреднив изображения внутри классов.
Примером успешного применения такой стратегии служат результаты исследования быстрых натриевых каналов, полученных в очищенном виде после солюбилизацин мембран электровозбудимых тканей 1617]. функционирование этих белков обеспечивает потенциалзависимое изменение ионной проницаемости мембран и, тем самым, прохождение электрических импульсов вдоль нервных волокон. Визуальный анализ микрофотографии солюбилизированных препаратов (рис.1.74) позволяет обнаружить два класса изображений Р и с. ).74. Микрофотографии солюбилизироваиного препарата Р)а-каналов Нсгатиннос кпнтрастироаанис 2%-ным водным раствором уранилацстата.
а — общий еид и б — застизгы типа "«надрал" (еасрху) и палач кообразные сз руктуры (книзу) при болыцем уаслитснии. аыбраиныс для анализа с помощью ззнфроного процсссинга Р и с.!.75. Усредненные проекции структуры )та-канала и.к — прпскции, лыннлониыс и препаратах белка, реконструиронанных л лнззилныс мембраны Л вЂ” нроскцин, кылилнс мак только к нрелара ых гол юбилизирпщннпго полка частиц: напоминающие по форме квадрат (рис. 1.74, а) и удлиненные палочкообразные (рис. 1.74, б).
Тонкая структура этих частиц, выявляемая с помощью цифрового процессинга нх изображений, представлена на рис. 1.75, а,б. Частицы типа "квадрат" представляют собой розеткообразные структуры. Аналогичные структуры наблюдаются также прн исследовании препаратов быстрых натриевых каналов, реконструированных в липидные бислои. Однако в этом случае удается выявить и второй тип розеток меньшего размера (рис,1,75, 6). Поскольку два типа розеток характерны для мембранной формы белка, предполагают, что они являются проекциями его структуры и на внутриклеточную поверхность мембран.
Палочкообразные частицы, обнаруживаемые только в солюбилизированных препаратах канала, представляют собой, по-виднмому, его боковую проекцию. Статистическую достоверность основных параметров полученных проекций удалось подтвердить с помощью крисгаллографического подхода. Попытки получить двухмерные кристаллы натриевого канала не увенчались успехом. Однако были получены тонкие трехмерные кристаллы, проекционная структура которых была установлена методами электронно-микроскопической кристаллографии. Как видно из рис.
1.76, а, проекция на плоскость (и, 1с, о) содержит два типа структур, основные параметры которых совпадают с мембранными проекциями, выявленными корреляционным анализом (рис. 1.76, б), хотя и наблюдаются некоторые различия в количестве и высоте максимумов белковой плотности. Вместе с тем боковая проекция, выявленная корреляционным анализом, эквивалентна кристаллической проекции на плоскость (о, )с, 1) (618). Наличие трех главных проекций: двух мембранных и боковой, дает возможность представить натриевый канал в мембране в виде суженного в центральной части цилиндра, верхний н нижний диаметры которого неодинаковы (рис. Е77). Высота канала (85 А), равная максимальному параметру боковой проекции, заметно превышает толщину липидного бнслоя.
Белок натриевого канала, являющийся функционально трансмембранным, пронизывает мембрану, и, по-видимому, значительная часть полипептидных цепей, образующих его, экспонирована на обеих мембранных поверхностях. Обращает на себя внимание выраженное сходство проекционных структур белка натриевого канала и ацетнлхолинового рецептора [619).
Геометрические параметры проекций несколько меньше в случае белка натрисвого канала. Однако в обоих случаях мембранные проекции имеют розеткообразную форму, число пиков белковой плотносги у них также одинаково. В центре розеток имеется область с пониженной плотностью. В ацетилхолиновом рецепторе эта область отождествляется с устьем ионного канала. Поскольку проекционные структуры обоих мембранных каналообразующих белков сходны, предложенные на их основе модели пространственной организации также имеют много общих черт (рис. 1.78) (620).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
