Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 48
Текст из файла (страница 48)
В связи с тем, что общий объем протомера (170000 аьз) соответствует 150 кДа, то на модели (рис. 1.66) эти домены образованы четырьмя верхними и четырьмя нижними сечениями. Пять сечений, расположенных в средней части, являются гидрофобным сегментом, и его высота (40 А) хорошо согласуется с обычной толщиной липидного бислоя. Трехмерная структура с разрешением 20 ай не позволяет установить взаимное расположение а- и 5-субъединиц в протомере. В таком случае для изучения субъединичной топографии может быть применен подход, состоящий в раздельном изучении пространственной структуры субъединиц и нх сопоставлении со структурой молекулы фермента.
С этой целью была выделена 0-субъеднница (х(а', К'-АТРазы и получены двухмерные кристаллы белка. Аналогично случаю полного фермента используемый препарат представляет собой мембранные фрагменты, содержащие р-субъединицу в качестве единственного белка. Медленное охлаждение суспензии таких мембран до 4' в присутствии ионов Мййа или Саха приводит к формированию двухмерных кристаллов (рис.
1.53). Поскольку кристаллизация полного фермента проводилась в присутствии ионов Мйы, то для изучения структуры ф-субъединицы были выбраны кристаллы, формирующиеся в присутствии этого иона. Напомним, что параметры элементарной ячейки составляют: а = 77А, Ь = 177А и у = 63' н они относятся к плоской группе симметрии р21. Элементарная ячейка кристалла образована двумя основными областями, недоступными для контрастирующего вещества, и ерце одной дополнительной областью, проходящей в виде непрерывной полосы через всю ячейку (рис. 1.53, а,б соответственно). Расчеты трехмерной структуры проводили для пространственной группы Р2, используя электронные микрофотографии кристаллов в диапазоне углов наклона +60'. Трехмерная модель структуры двух основных недоступных для контрасгирующсго вещества областей (а на рис.!53) представлена на Р и с.
!.6Ъ Трехмерная модель элементарной ячейки. Мам-формы кристалла В- суй ьединицы !ха~,к+- ЛТРазы Р и с. !.6К Трехмерная модель злементарной ячейки кристалла цитохром-с-оксидазы рис. 1.67 в виде сечений толщиной 6,5 А параллельных плоскости мембраны (585). Если принять парциальный объем белка равным 1,3 Аз/Да [610), то масса каждой такой области составит 40 кДа, что хорошо согласуется с молекулярной массой одной !)-субъединицы 35 кДа (612]. Дополнительный район (Ь на рис. 1.53) в трехмерной модели не представлен, так как он является, по-видимому, фрагментом липндного бислоя.
Об этом свидетельствует его высота (40 А) и локализация вдоль с-оси трехмерной ячейки кристалла; в той ее части, где находятся гидрофобные домены !3-субъединиц (см. ниже). Таким образом, в состав элементарной ячейки кристалла входят две б-субъединнцы, Особснностыо их пространственной структуры 199 является выраженная асимметрия распределения массы вдоль направления, перпендикулярного плоскости мембраны. Иммунохимическим анализом участки полипептидной цепи [3-субъединнцы удалось обнаружить только на внеклеточной мембранной поверхности [582).
По данным химической модификации Ха', К'-АТРазы в составе нативных мембран и "п8Ы-зЫе-оп1" протеолипосом, организация [3-субъединнцы в мембранах характеризуется значительной асимметрией: гидрофильные участки полипептндной цепи образуют один гндрофильный домен, экспонированный на внеклеточной мембранной поверхности [613).На внутриклеточной поверхности по этим данным может находиться не более 10% молекулярной массы.
Анализ профиля гидрофобности аминокислотной последовательности [3-субъединицы позволяет предположить наличие не более, чем четырех ее трансмембранных участков [612), что соответствует массе внутримембранного домена 10 кДа. Это хороню согласуется с данными по химической модификации непроникающими реагентами и гядрофобному мечению [613, 614). Таким образом, массы гидрофильного и гидрофобного доменов составляют соответственно 25 и 10 кДа. (Следует иметь в виду, однако, что такие расчеты массы для гидрофобного домена должны рассматриваться лишь как оценка "сверху", а для гидрофнльного — как оценка "снизу"). В соответствии с такими оценками на модели (рис.
1.67) гидрофильный домен представлен восемью сечениями относительно широкой части модели, а остальные сечения образуют ее гидрофобный домен. Именно в этой части трехмерной элементарной ячейки кристалла расположен дополнительный район, недоступный для контрастирующего вещества (рнс.
1.53,6) и являющийся, по-видимому, фрагментом липидного бислоя. Характерной особенностью структуры элементарной ячейки кристалла 8-субъединицы является отсутствие выраженных контактов между соседними молекулами. В случае Ха', К'-АТРазы а,[)-протомеры имеют область контакта, расположенную асимметрично относительно мембраны (рис.
1.66). Это свидетельствует о том, что образование димеров Ха', К~-АТРазы обусловлено взаимодействием а-субъединиц и область контакта находится на внутриклеточной мембранной поверхности, так как именно там экспонирована основная часть их молекулярной массы. Кроме того, сравнение трехмерных структур 8-субъединицы и а,[3- протомера (рис, 1.66 и 1.67) выявляет подобие гидрофильного домена 8- субъединнцы и верхней части а,б-протомера.
Аналогичное исследование было проведено для мультимолекулярной системы цитохром-с-оксидазы — терминального компонента дыхательной цепи всех аэробных организмов [615). Субъединичный состав этого комплекса варьирует в зависимости от источника выделения. В митохондриях сердца быка он образован 12 субъединицами. Их молекулярные массы составляют:! — 57, Д вЂ” 26, 1П вЂ” 30, 1Ч вЂ” 17, т' — 12,5 кДа, а для остальных эта величина лежит в двапазоне 5 — 10 кДа. Реконструкция трехмерной структуры (рнс, 1.68) показывает, что по форме молекула напоминает букву У, ее высота составляет 11 нм н она состоит из трех доменов. Два верхних (М~ н Мз), по крайней мере, частично эк- 200 спонированы на внешней поверхности мембраны и расстояние между центрами их масс составляет 4 нм.
Значительная часть массы третьего домена (С) экспоиирована в цитозоль. Комбинирование этих результатов с многочисленными данными по химической модификации гидрофоб- ными и гидрофильными соединениями, кросс-сшивающими реагентами и иммунохимического мечения позволило предложить топографическую модель структуры цитохром-с-оксидазы в мембране, представленную на рис. 1,69. При электронно-микроскопическом исследовании разрешение может быть ограничено многими причинами, главными из которых являются степень упорядоченности кристаллов и способ их подготовки к микроскопированию. Обычно такие кристаллы легко разрушаются электронным пучком и их приходится заключать в тонкие пленки контрастирующего вещества.
Подобная процедура увеличивает радиационную стабильность кристаллов, повышает контрастность изображений, но значительно ухудшает разрешение. Предельное разрешение в этих случаях определяется зернистостью контрастирующего вещества (или размером его кристаллов)и не превышает 15-20 А. В ряду объектов, исследованных методами трехмерной электронной микроскопии, следует выделить бактериородопсин. В галофильных бактериях этот белок, функционирующий как светозависнмый "протонный насос", организован в так называемые пурпурные мембраны — участки клеточной мембраны, содержащие бактериородопсин в кристаллической упаковке. Другими словами, бактериородопснн функционирует в клетке в форме двухмерных кристаллов, которые могут быть выделены в высокочистом состоянии. Уникальной особенностью таких природных кристаллов оказалась их очень высокая упорядоченность и радиационная стабильность.
Последнее обстоятельство позволило провести нх исследование без применения негативного контрастировання [610), Методом электронной дифракциит иа таких кристаллах были определены амплитуды структурных факторов вплоть до разрешения 6 — 7 А в плоскости мембраны. Изображения неконтрастированных пурпурных мембран характеризуются низким контрастом (< 1%). Цифровая обработка их позволила рассчитать и значения фаз для этого набора структурных факторов. И хотя трехмерный набор данных, созданный в результате анализа "наклонных серий" изображений, имел разрешение в направлении нормальном к плоскости мембраны 14 А, реконструкция трехмерной структуры позволила описать нс только внешнюю форму, но н внутреннее строение молекулы.
Оказалось, что полипептидная цепь бактернородопсина, состоящая из 248 амннокислотных остатков, образует семь а-спиральных трипс-мембранных сегментов" (рнс. 1.70). При этом общая высота 7 Элскзроггная дифракция — один из режимов работы электронного микроскопа, при кото ром отключаю г ток в объективной линзе, формируюшей изображение объекта. "Дою иг нутое разрешение не позволяет визуализировать втори шую структуру полипептидной цепи, к гнформшнш п-спнрвли была показана с помощью рентг еновскои диф ряк Пан. "0! чй Р и с.
!.69. Модель молекулы цитохром-с-оксидазы с указанием возможного расположения образующих ее субъедиинц Р и с. !.70. Трехмерная модель элементарной ячейки кристалла бактериородопсина Р и с. !.7 !. Модель укладки полипептидной цени бактериородолсина в мембране Зив рниаанныс < Сласуи ткани ын нн ныивлснныс ан~нгснныс Хсюрминанзы 202 молекулы соответствует толщине липидной мембраны (- 40 А), гго указывает на то, что основная часть молекулы белка погружена в мембрану и лишь нсболыпие участки полипептидной цепи экспониро ваны на ее поверхностях. Такой вывод впоследствии удалось подтвер дить с помощью методов ограниченного протеолиза и иммунохимического мечения с использованием моноклональных антител к синтетическим фрагментам полипептидной цепи (рис.
1.71). Главным фактором, лимитирующим разрешение в описанном выше исследовании, являлось радиационное разрушение кристаллов в ходе съемки. В последние годы заметное развитие получили методы электронного микроскопирования при низких и сверхнизких температурах, которые позволяют многократно повышать радиационную устойчивость биологических объектов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
