Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Как правило, частицы а-латротоксина равномерно распределены по подложке и адсорбируются на нее в произвольных ориентациях. Однако при высокой концентрации ионов Мйы (0,5 М) и в узком диапазоне рН (8,2 — 8,5) а-латротоксин агрегировал в двухмерные кристаллы, что наблюдалось при негативном контрастировании таких препаратов (рис. 1.62,6) (608!.
Кристаллы имели размеры до 0,4 мкм, изображения некоторых из ннх давали отчетливую оптическую дифракцию, что позволило провести Фурье-фильтрацию изображений на ЭВМ с применением кристаллографических программ. На рис. !.63,а представлена карта распределения контрасгирукпцего вещества в элементарной ячейке кристалла после Фурье-фильтрации с разрешением 4 нм. Параметры ячейки а = Ь = 15,55 нм, у = 90', соотношение между амплитудамн н фазами рефлексов, а также высокие коэффициенты кросс-корреляции изображения самого с собой при его вращении на 90, 180 н 270' (рис. 1.63,6) позволяют заключить, что кристаллы принадлежат к двухсторонней плоской группе симметрии р4, С учетом симметрии было рассчитано распределение контрастирующего вещества в кристалле, контурная карта которого приведена на рис.!.64. Полученная проекция белковой части элементарной ячейки а-латротокснна имеет вид квадрата со стороной около 11 нм, который имеет в центре минимум 2,5 нм в диаметре и восемь (четыре больших и четыре малых) максимумов белковой плотности.
Наличие осн симметрии четвертого порядка указывает на то, что элементарная ячейка кристалла состоит из четырех одинаковых частей (4-, 8-, !2-..полнпептидных цепей). Молекулярная масса протомера, по данным электрофореза и пептидного анализа, составляет 130 кДа. Расчет этого !94 ч УУ ф к р Д бр Й ьй УУ ДУУ РДУ УУУ Улл 3роглелил, грод. Р и с.
!.63. Изображение одной элементарной ячейки двухмерного кристалла алатротоксина после Фурье-фильтрации (а) и кривая автокорреляции этого изображения при вращении вокруг оси, проходящей через его центр (6) Р и с, !.64. Изображение элементарных ячеек двухмерного кристалла и-латротоксина после Фурье- фильтрации с учетом поворотной симметрии четвертого порядка В каждой ячейке непоступная для контрвстврв область представляет собой квадрат со стороной !!О А н кодер;кнт четыре основных пика белковой ллотноетн параметра на основе структуры полноразмерного гена дает величину 157 кДа.
Предполагая, что элементарная ячейка образована четырьмя протомерами с молекулярной массой 130 4 = 520 или 157 4 = = 628 кДа, а также считая, что ее удельный парциальный объем близок к величине 1,3 Аз/Да, получаем нижнюю оценку для толщины двухмерного кристалла — 5,6 и 6,7 нм соответственно. Для восьми полипептидных цепей (1040 или 1256 кДа) этот параметр будет составлять 11,2 и 13,4 нм. Большее количество протомеров не будет укладываться в данный объем, так как рассчитанные величины являются оценками снизу, а размеры белковых частиц не превосходят 15 нм. Таким образом, полученная информация о симметрии кристаллов а-латротоксина указывает на то, что в состав его частиц, выявляемых тв !95 ьное р и с.
Ь65. Схематическое июбражение трансформанты Фурье двухмерного кристалла, представлнющей собой решетку линий, перпендикулярных к плоскости кристалла Ось нак прн негативном контрастировании, входят 4 или 8 протомеров. Это не позволяет сделать однозначное заключение о составе функционально активной молекулы токсина. Однако то обстоятельство, что минимальной структурной единицей, проявляющейся как для одиночных частиц, так и для двухмерных кристаллов, является тетрамер или октамер, говорит о том, что в распюре белок существует в виде олигомеров идентичных полипептидов. Более детальная информация об относительном расположении полипептидов и нх пространственной структуре может быть получена после реконструкции трехмерной структуры молекулы по наклонным изображениям данных кристаллов.
Определение трехмерной структуры белков по данным электронного микроскопнрования двухмериык кристаллов, Получение объекта исследования в форме двухмерных кристаллов создает хорошую предпосылку для определения его пространственной структуры. Прн этом разрешение, с которым в конечном итоге может быть рассчитана пространственная структура, определяется многими факторами. Главным является качество кристаллов; степень их упорядоченности, размеры, стабильность и др.
В отличие от плоской дифракции отдельного изображения полная дифракционная картина от трехмерного объекта представляет собой пространственную решетку. Для расчета трехмерной структуры с помощью Фурье-синтеза необходимо найти амплитуды и фазы рефлексов с индексами 1, ие равными нулю. Это можно сделать, анализируя изображения, снятые в микроскопе при наклоне кристалла относительно оптической оси прибора. Напомним, что согласно теореме проектирования Фурье-трансформанта любого изображении является одним из центральных сечений трехмерной трансформанты [580].
На рнс, Бб5 векторы а* и Ь' задают плоскость такого сечения в обратном пространстве, на которой находятся максимумы с индексами (Ь, 1, о). Через максимумы можно провести линии обратной решетки, нормальные к этой поверхности, на которых и должны располагаться максимумы с индексами! = О. Трансформанта наклонного изображения, являющаяся также центральным сечением, задает другую плоскость, пересекающую линии обратной решетки, и значения амплитуд н фаз ~96 дифрагированных лучей в точках пересечения. Аналогичные операции со всей совокупностью наклонных изображений, снятых в максимально широком диапазоне углов наклона, позволяют провести много таких новых плоскостей и, следовательно, построить полную трехмерную трансформанту, т.е.
определить амплитуды и фазы для всех узлов обратной пространственной решетки. Далее, используя полученную информацию, с помощью Фурье-синтеза, аналогично процедуре в рентгеноструктурном анализе, рассчитывают пространственную структуру как распределение рассеивающего электроны вещества в объеме элементарной ячейки кристалла. Суммируя вышеизложенное, можно сказать, что исследование пространственной структуры двухмерных кристаллов состоит из нескольких этапов: 1) получение микрофотографий кристаллов в максимально доступном диапазоне углов нх наклона относительно оптической оси микроскопа; 2) получение Фурье-трансформант изображений и нх фильтрация от шумов; 3) комбинирование всех изображений для построения трехмерной трансформанты и определения структурных факторов; 4) Фурье-синтез пространственной структуры.
К настоящему времени для нескольких мембранных белков выполнены такие реконструкции трехмерной структуры. Показательным примером может служить Ха', К'-АТРаза почек свиньи. Как было показано в предыдущем разделе, Ха', К'-АТРаза может быть закрнсталлизована в нескольких различных формах. Для изучения трехмерной структуры наиболее подходящей является кристаллическая форма 2, поскольку в присутствии ионов Мдт', КОЗ и К' она является доминирующей и эти кристаллгя обладают более высокой симметрией, чем, например, форма 1. Трехмерная реконструкция выполнена в пространственной группе Р2 на основе данных пяти независимых наклонных серий [609[. Полученная таким образом пространственная структура, представленная в виде параллельных плоскости мембраны сечений высотой 7,5 А, приведена на рис.
1.66. Элементарная ячейка образована двумя идентичными белковыми массами, Рассчитанный объем структуры составляет 340000 Аз. Если принять парциальный объем белка равным 1,3 А'/Да [610[, то молекулярная масса составит 260 кДа, что хорошо согласуется с молекулярной массой двух а,р-протомеров (280 кДа) [611, 6121. Поскольку кристаллизация белка достигалась без полной солюбилизацни мембран, протомеры имеют одинаковую ориентацию относительно плоскости мембраны. Высота протомеров составляет 100 А, что значительно превышает обычную толщину лнпндных мембран.
Поэтому следует ожидать, что значительная часть массы каждого протомера экспоннрована на мембранных поверхностях. Анализ гидрофобности аминокислотных последовательностей а- н В-субъединнц [611, 612), а также данные по гидрофильному и гидрофобному меченню белка в составе открытых мембранных фрагментов и "[из[сне-он1" протеолипосомах [609[, показывает, что внутрнмембранный домен протомера образован не более чем 25'7— ми массы каждой субъединицы н его суммарная молекулярная масса пе !97 Р и с. Ь66. Трехмерная модель элемен- тарной ячейки кристалла йка+,Ка-Лтраэы Прсааслагаемый мембранный фрагмент окра- шен а асмный Ласт 4.; превышает 40 кДа. Таким образом, 75% массы а- и б-субъеднннц распределены между вне- и внутриклеточным доменами протомера.
По данным химического мечсния флюорсскамином соотноше- —., " ф ние масс этих доменов для а-субь- единицы составляет 3:1. Полипеп,,г тидная цепь Д-субъединицы экспонирована только на внеклеточной поверхности мембраны [582). В сок ответствии с этим молекулярные массы гндрофильных доменов прото- мера на обеих мембранных поверхностях составляют около 50 кДа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
