Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 46

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 46)

1.60). Первая модель предполагает асимметричное встраивание белковых молекул в липидный бислой: все периферические части Е~ расположены по одну сторону мембраны, образующей двухмерный кристалл. Согласно второй модели, встраивание происходит с обеих сторон липидного бислоя: на каждую элементарную ячейку кристалла приходится две противоположно ориентированные в мембране молекулы АТР-синтетазы. Следует отметить, что в соответствии с первой моделью (рис. 159) должны существовать два типа проекционных изображений: вид двухмерного кристалла со стороны периферических частей Еь приведенный на рис. 158, и совершенно отличный от него вид с противоположной стороны мембраны.

Поскольку изображений, соответствующих последнему типу, обнаружить не удалось, предпочтение отдают второй модели. В ее пользу свидетельствует и тот факт, что только эта модель предполагает, что в двухмерном кристалле АТР-синтегазы упорядоченное расположение белковых молекул в липндном бислое обеспечивается их взаимодействием друг с другом как внутри белкового рида, так и между рядами.

Первое осуществляется за счет периферических частей Р, соседних молекул, а второе за счет внутримембранных частей Еш Последнее взаимодействие может иметь место только в случае второй модели, для которой расстояние между соседними белковыми рядами в 2 раза меньше, чем в первой модели, и составляет - 12,8 нм, что хорошо соответствует максимальному продольному размеру Е~ (12 нм, см. [597]).

Что касается первой модели, то, согласно ей, взаимодействие между соседними белковыми рядами осуществляется за счет липидного окружения. Маловероятно, что такие взаимодействия могут стабилизировать упорядоченное образование типа двухмерного кристалла. Другим примером кристаллизации реконструкцией служат реакционные центры зеленых бактерий Са)огойехпз авгаш)аспз. Этот мембранный белок, играющий ключевую роль в процессах бактериального фотосинтеза, образован двумя типами субъединиц — 1.

и М с молекулярными массами 28 и 32 кДа соответственно 1598, 5991. Для получения двухмерных кристаллов в исходную фракцию реакционных центров (РЦ) (10 мг РК/мл в 50 мМ Трис-НС1-буфера, рН 9,0, содержащего 0,1% ЛДАО) добавляли солюбилизированный фосфатидилхолин в соотношениях от 2;1 до 1:2 (по массе). Реконструкцию реакционных центров в двухмерные кристаллы осуществляли путем дналнза от детергента.

При этом варьировали следующие параметры: 190 рн .Ьы троаанно нне лвухм еталлов ре центров температуру, прн которой проводился анализ, ионную силу, ионный состав, отношение липид/белок, рН, скорость диализа 16001. Наиболее существенными параметрами кристаллизации оказались температура (20') и рН среды (8,0). Максимальный линейный размер кристаллов достигал 2 мкм. Относительное количество таких кристаллов от общего числа мембранных фрагментов в препаратах составляло - 50%.

По данным Фурье-анализа и оптической дифракции разрешение иа таких кристаллах достигает 2-3 нм. Фурье-синтез изображений кристаллов проводился для двухсторонней плоской группы р1. Отфильтрованное изображение негативно-контрастированного кристалла реакционного центра (четыре элементарные ячейки) представлено на рис. 1.61. Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 5,7 нм, Ь = 5,9 нм, у = 70'. Из рнс.

1.61 видно, что в элементарной ячейке кристалла можно выделить два различных по размерам локальных максимума белковой плотности с расстоянием между их центрами 3 нм. Неодинаковость этих максимумов по размерам, с одной стороны, может быть обусловлена артефактами электронно-микроскопического контрастирования (например, неравномерностью распределения контрастирующего вещества по кристаллу), с другой стороны, различной степенью экспонированности структурных единиц кристалла из плоскости (а, и) в случае, если каждый локальный максимум соответствует одной и той же структурной единице, имеющей одинаковую ориентацию относительно плоскости кристалла. Локальные максимумы плотности также могут отражать разную ориентацию структурных единиц кристалла относительно плоскости (а, Ц или соответствовать различным структурным единицам.

Сравнение аминокислотных последовательностей Ь- и М-субьединиц Сйй апгапбаспа н пурпурных бактерий [598, 599, 601 — 6031 позволяет сделать вывод о высокой степени их гомологии. По данным )9! рентгеноструктурного анализа, гетеродимер нз пурпурных бактерий, образованный ).- и М-субъединицами реакционного центра, представляет собой цилиндр с эллиптическим поперечнзпм сечением. Высота цилиндра 5 нм, большой и малый диаметры эллиптического сечения равны соответственно 6 и 4 нм )602].

Из сопоставления размеров эллиптического сечения гетеродимера и элементарной ячейки двухмерного кристалла реакционного центра следует, что на одну элементарную ячейку приходится один гетеродимер, состоящий из 1.- и М-субъединиц, Поскольку параметр Ь = 5,9 нм практически совпадает с большим диаметром сечения гетеродимера (6 нм), можно сделать вывод, что гетероднмеры в двухмерном кристалле плотно прилегают друг к другу своими гидрофобнымн поверхностями в направлении Ь, а в пространстве между ними в других направлениях находятся молекулы липнда. Это может быть установлено, вероятно, при построении трехмерной модели кристалла.

В дальнейшем представляется перспективным получение двухмерных кристаллов комплексов реакционных центров с другими компонентами фотосинтетической системы (например, с молекуламн антенного аппарата) с целью изучения нх надмолекулярной организации, как это было сделано, например, при изучении цнтохром-редуктазы [604). Еще один пример — аргиопининсвязывающий белок (АСБ), выделенный из мембран коры головного мозга. Молекулярная масса полипептидной цепи составляет — 68 кДа )605). Двухмерные кристаллы получали диалнзом от детергента смеси АСБ и ДМФХ, солюбнлизированных ф-сз-октнлгликозидом )606). Средний продольный размер таких кристаллов составляет - 0,2 мкм, поперечный 0,05 мкм. Кристаллы представляют собой ленты двухмерных слоев, свернутые в трубы. Вероятно, при кристаллизации первоначально молекулы АСБ собираются в нитевидные структуры, которые далее ассоциируют друг с другом, образуя ленты двухмерных слоев. Такие ленты в свою очередь образуют трубообразные структуры, в дальнейшем уже не склонные к более высокой степени ассоциации.

Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 8,3 нм, Ь = 8,9 нм, у = 99'. Как отмечалось, разрешение на таких кристаллах составляло около 3 нм, т.е. меньше предельного разрешения метода негативного коитрастировання, которое ограничено приблизительно 2 нм. Применение иа первых этапах цифровой обработки изображений методов кросс-корреляционного анализа позволяет несколько повысить разрешение. Однако существенное увеличение разрешения можно ожидать при повышении степени упорядоченности кристаллов за счет дальнейшей оптимизации методов кристаллизации. Кроме того, двухслойность полученных кристаллов затрудняет как интерпретацию их проекционной структуры, так н дальнейшую работу по определению нх трехмерной структуры.

Одной нз общих особенностей двухмерных кристаллов различных мембранных белков является их полиморфизм, т.е. одновременное существование нескольких кристаллических форм. Изменение условий 192 Р и с, !.62. Микрофотографии препаратов а-латротоксина в форме двухмерных крис- таллов (а) и одиночных молекул (б) Контрастароаанне 1%-ным воаным раствором ураннаапстата кристаллизации обычно меняет лишь их относительное содержание.

Такой полиморфизм может отражать динамику процесса кристаллизации, а также являться следствием существования нескольких конформационностабильных состояний молекул белка. Параллельное структурное исследование различных кристаллических форм обычно является полезным при установлении и интерпретации их пространственной структуры.

Кристаллизация водорастворимых белков. В заключении раздела, 2. Проблема белка, т. 2 193 посвященного кристаллизации, следует сказать, что двухмерные кристаллы могут быть получены не только для интегральных мембранных белков, но и для некоторых водорастворимых, которые могут существовать в растворах в отсутствие детергентов. К ним относится а-латротоксин, являющийся основным токсическим компонентом яда паука каракурта. Этот белок состоит из идентичных негликознлированных полипептидных цепей, в состав каждой из которых входит 104! амннокислотный остаток [607!. При негативном контрастированин гомогенного препарата а-латротоксин выявляется в виде частиц, имеющих размеры в пределах 10-15 нм (рис.

1.62,а). При сохранении ряда общих черт частицы могут довольно значительно отличаться друг от друга, что свидетельствует о большой вариабельности ориентаций частиц токсина на пленке-подложке. Это затрудняет применение методов обработки одиночных изображений молекул в данном случае, так как для получения набора статистически достоверных проекций молекулы, соответствующих различным ориентациям частиц на пленке-подложке, потребовалось бы обработать большое количество изображений. С другой стороны, цифровая обработка электронно-микроскопических изображений упорядоченных образований белка могла бы существенно сократить время, необходимое для получения трехмерной структуры.

Характеристики

Список файлов книги