Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 45
Текст из файла (страница 45)
1.55. Микрофотография однословной оротсолинтюомы Рсконструклиоиная система соевый фосфатилилколин — ЛДАΠ— Р1РВ-Атравы в соотношении 1.!.1 !оо массе), рн б. Контрастирование 0,11%-ным волным раствором уранилалетата Стрелки указывают на алнночные молекулы Р1РО-Атраты. Калибровка — О,! мкм константы мицеллообразования которых равны соответственно 1,4 и 25 мМ [594, 595). В данном случае имеет место хорошее встраивание интактного белкового комплекса в липидный бислой, однако двухмерные кристаллы н нитевидные структуры в таких условиях получить не удалось. Вероятно, это связано с индивидуальными особенностями структур соответствующих детергент — липид белковых мицелл. В качестве липида, кроме фосфатидилхолина из соевых бобов (СФХ), использовали: яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) и синтетический димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ).
Встраивание Р,Р1РАТРазы в бислой из ЯФХ имеет место, однако образование двухмерных кристаллов и нитевидных структур обнаружено не было. Возможно, это связано с меньшей подвижностью молекул ЯФХ в образующемся бислое по сравнению с СФХ (температуры фазового перехода гель — жидкий кристалл для ЯФХ и СФХ близки к 0', но для ЯФХ она немного выше) и согласуется с тем, что использование ДМФХ (температура фазового перехода 23') приводило к образованию больших мембранных фрагментов с отдельно встроенными молекулами Е!Р1РАТРазы. Кроме того, в данном случае су!цественно возрастала доля чисто липидных образований: мембранных фрагментов, не содержащих белковых молекул, и липосом.
Поскольку эксперименты по реконструкции проводили при комнатной температуре (- 20'), при которой ДМФХ находился в относительно жестком гелеобразном состоянии, то, по-види- !84 Р и с. 1.56. Микрофотографии мембранных фрагыентон, полученных в тай же конст- рукцнонной системе, что н на рнс. 1,55, но прн рН 4,5 а — вреекция в плоскости мембраны; б — латсральиая враскпия; в — ебщснривятая мелел ь Р1 Рй— АТРазы в лилилией мембране. Кеитрастированис Обйвным нотным раствором уранилаистата Стрелки указываим иа отасльигяс молекул~а белка Калибровка — 04 мкм Р и с. 1.57. Микрофотографии нитевидных структур Коюрасгнраваннс О,1%-ным вовным рапвором ураннлаистата.
Стрелки указывают на овнначньк молекулы Ргдгултгазьь Калибранка — 0,1 мкм мому, это затрудняло встраивание белковых молекул в липидный матрикс. Таким образом, для успешной реконструкции Р1РО-АТРазы в липидный бислой необходимо наличие в диализуемой смеси молекул фосфатидилхолина с различной длиной и степенью насыщения углеводородных цепей (как в случае СФХ или ЯФХ), что обеспечивает более точное соответствие липидного окружения внутримембранной части белкового комплекса. При этом встраивание молекул АТРазы в липидный бислой менее избирательно по отношению к типу используемых для реконструкции детергента и липида, чем упорядоченность белковых молекул этого комплекса в липидном матриксе. Для получения плоских мембранных фрагментов с плотно упакованными в них молекулами белка наиболее подходящими в качестве детергента оказались системы ЯФХ или ЛДАО.
Однако для получения двухмерных кристаллов необходимо оптимизировать и ряд других параметров реконструкционного эксперимента: рН, ионную силу, добавку двухвалентных катионов и др. Данные по влиянию рН на образование мембранных структур Его-АТРазы в этой реконструкционной системе приведены в табл. 1.!6. Образование протеолипосом и мембранных фрагментов происходит практически по всему диапазону рН от 3,3 до 8,5, однако размеры таких структур могут сильно варьировать. В двух диапазонах рН: 3,3-3,7 и 5,0-6,4 происходит образование болыпих моноламеллярных протеолипосом (до 1 мкм в диаметре) (рис.
1.55). При рН около 7 протеолипосомы невелики по размерам (О,1- 0,3 мкм). Большие мембранные фрагменты (линейные размеры 0,5- 1,0 мкм) присутствовали в препаратах с рН 4,3-8,5 (рис. 1.56). При значениях рН < 4,3 происходит образование небольших мембранных фрагментов (линейные размеры < 0,3 мкм). Таким образом, варьируя рН, можно подобрать условия для получения протеолипосом и мембран определенного размера.
Образование нитевидных структур в препаратах Р1РггАТРазы происходит в узком диапазоне рН (около 4,8). Нити могут быть замкнуты в кольцо и иметь продольные размеры до 1 мкм, поперечные в пределах 186 Таблица!лб влияние РН среды на образование мембраиныл структур Р!Гв-АТРазы 3,0-3,2 0,2-0,3 3,3-3,7 0,3-0,5 3,8-4,2 4,3-4,6 4,7-4,9 5,0-5,5 5,6-6,4 До 0,3 До! 0,5-1 0,5-1 0,5-1 До 0,4 До 0,4 До 1 До 1 0,3-0,6 0,5 — 1 До 0,5 6,5-7,2 7,3-8,5 До 0,3 Примечание.
Описаннью выше структуры были получены при следующих условиях. СФХ)ЛДАО)Р(рб-Атразы (1:1:! по массе); канцентраци» Р!Рб-Аттазы 3 мг/мл; состав буфера для диализа: 50 мм СН)СООХа (при рН 3,0-6,4) нли 50 мм трис-НС! (прн рН 6,5-8,5), 5 мм М8С12, 50 мм ХаС), 5 мм Нап зРО4; продолжительность диализа 24 ч; ! = 20'. Структурные образования салержатся в образцах в нсзначительмых количествах.
187 0,015-0,02 мкм. Типичные электронные микрофотографии таких структур приведены на рис. 1.57. Эти структуры, по-видимому, представляют собой расположенные в два ряда молехулы Е!Рб-АТРазы, присоединенные друг к другу своими гидрофобными областями. Основную роль в таких взаимодействиях должен играть мембранный сектор Рб, а внемембранные части комплекса, вероятно, экспонированы на поверхности нити. Возможно, что нитевидные образования в силу их относительной упорядоченности являются промежуточными структурами перед образованием двухмерных кристаллов. Это согласуется с тем, что диапазоны рН образования нитей и двухмерных кристаллов практически совпадают (табл.
1.16). Для образования двухмерных кристаллов Р)Р0-АТРазы характерен узкий диапазон рН: 4,5-5,0. Типичные электронные микрофотографии таких кристаллов представлены на рис. 1.58 15961. Максимальный линейный размер кристаллов составляет — 0,4 мкм. Как видно из микрофотографий, электронноплотные области, отвечающие белковым молекулам двухмерного кристалла, в проекции на плоскость мембраны образуют характерные полосы шириной - 12 нм. Расстояние между центрами полос составляет — 25 нм.
По данным оптической дифракции и Фурье-анализа, разрешение на Р и с. йзк Микрофотографии двухмерных кристаллов Р1 Рб-АТРазы и — - монокрисгалл; б — мембранный фрагмент, садержащий несколько кристаллических областей с различной ориентацией решетки.
Контрастнрование ОДГЬ-ным водным раствором уранилацетата. Калибровка в 03 мкм изображениях двухмерных кристаллов составляет — 2,8 нм. Элементарная ячейка имеет следующие кристаллографические параметры: а = 13 нм, Ь = 25 нм, у = 86'. Отфильтрованное от статистических шумов изображение негативно контрастированного двухмерного кристалла (проекция на плоскость мембраны) представлено на рис. г.59. Незаполненные контрастером области, соответствующие белковым молекулам (негативное контрастирование белка), образуют характерные полосы в направлении вектора а. Известно, что одна из проекций Е,- АТРазы, называемая фронтальной, имеет гексагональную форму с Р и с.
1.59. Профильтрованное изображение двухмерного кристалла Г(ГбЛТРазы (нроекция на плоскости мембраны) Окружностями выявлены участки, соответствующие отасяьным молскулан белка; а я Ь— бвзиснью векторы элементарной ячсйяя Р и с. 1.60. Альтернативные модели структурной организации двухмерного кристалла Р(рб-АТРазы с одной (а) и двумя (б) молекулами белка на элементарную ячейку /суем поперечником — 12 нм, а боковые проекции форму прямоугольника нли параллелограмма с шириной в пределах 7,4-8 нм. Следовательно, каждая полоса состоит из выстроенных в один ряд молекул Е(рбАТРазы, причем периферические части Е), по-видимому, контактируют друг с другом н ориентированы своими фронтальными сторонами параллельно поверхности мембраны.
Таким образом, молекуле АТР-сннтетазы в проекции на плоскость мембраны соответствует область в виде круга диаметром — 12 нм, содержащая шесть максимумов белковой плотности вокруг полости, заполненной контрастером. Вклад в два из них (имеются в виду максимумы между соседними белковыми молекулами) вносится двумя молекулами АТР-синтетазы (рнс. 1.59). По всей вероятности, отсутствие гексагональной симметрии является результатом заметных искажений в упаковке молекул Р, на плоскости мембраны (именно онн ограничивают разрешение до — 2,8 нм).
Не исключен и небольшой наклон фронтальной стороны Р, относительно плоскости мембраны, вносящий свой вклад в нарушение гексагональной симметрии. Из сопоставления размеров злемснтарной ячейки кристалла 189 (13 . 25,3 нм) с размерами фронтальной проекции ЕнАТРазы (12 . 12 нм) можно заключить, что на одну элементарную ячейку приходится одна или две молекулы АТР-синтетазы. В первом случае непрокрашенная область двухмерного кристалла между соседними рядами из молекул АТР-синтетазы соответствует липидному окружению, а во втором — внутримембранной части Ра другой белковой молекулы,имеющей противоположную ориентацию в мембране. В соответствии с этим можно предложить две альтернативные модели структурной организации двухмерного кристалла: с одной или двумя молекулами АТР- синтетазы на одну элементарную ячейку 1рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
