Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Агрегация белковых частиц, индуцируемая снижением температуры, обусловлена, по-видимому, эффектом разделения фаз, связанным с переходом липидной фазы мембран из жидкокристаллического состояния в твердое. В подходящей среде кристаллы могут формироваться при инкубацни мембран при понюкенной температуре до нескольких градусов в течение 1 — 4 недель [583), Оказалось, что качество кристаллов зависит не только от температуры и времени ннкубации, но и скорости ее достижения. Наиболее эффективно "равновссноео охлаждение, при котором температура суспензии снижается от 37 до 0' в течение нескольких недель (584). Т а б л и ц а 1.13 Усноини кристаллизации н темнературиаи стабильность даукмериых аростаддоа р1ат, К+-АТразы Кристаллическак форма Лнтаид КЩ, мм Темиература','С -'тт03 0 — 150 0 — 6 — РОс 100 0 — 3 — РОс 0 0 — 7 'Указан диаилзон темлератур, ирн «отормх не ироисходит ухудшена» качества крнсталлон и течение 2 неделе.
В условиях, близких к оптимальным, содержание кристаллов может доходить до 50% от общего количества мембранных фрагментов, а их размер достигать 0,5 мкм. Оптимальные условия образования двухмерных кристаллов Ха', К'-АТРазы и их температурной стабильности приведены в табл. 1.13. Сопоставление электронных микрофотографий кристаллов, а также картин оптических дифракций и их профильтрованных изображений, показывает, что Ха', К'-АТРаза может кристаллизоваться в трех различных формах (рис.!.52).
Кристаллографические параметры элементарных ячеек кристаллов представлены в табл. 1.14. Минимальный размер элементарной ячейки характерен для кристаллов формы 1. На профильтрованных изображениях таких кристаллов видно, что элементарная ячейка содержит один пик плотности и образована, по-видимому, одним протомером (т.е.
парой а, 8-субьединиц). Для двух других форм (2 и 3) характерно наличие двух основных максимумов плотности на одну элементарную ячсйку кристалла. Площадь каждого из них соответствует площади, характерной для формы 1. Поэтому их элементарные ячейки образованы, по-видимому, парой а, 8-протомеров. Значение фаз днфракционных максимумов для кристаллов формы 2 и 3 близки к 0 илн 180' (стандартное отклонение при уточнении фазового центра не превышало !7'), а на профильтрованных изображениях отчетливо прослеживается наличие поворотной 178 РФУРФ ©ф)фф с РРРРР УУ,'РО О 1Э ' О 'ьх С ' Р и с. !.52.
Ыикрофото~рафин !а) и их профильтрованные изоораасения !б) трех форм двухмерных кристаллов ))а+, ККАТРазы (!, 2. 3 соответственно) оси второго порядка, перпендикулярной плоскости мембраны. Это дает основание отнести такие кристаллы к двухсторонней !рупие симметрии р21. Элементарная ячейка кристаллов формы 1 лишена дополнительных элементов симметрии, а фазы днфракционных максимумов имеют произвольные значения в диапазоне 0 — 360'. Позтому подобные кристаллы характеризуются низшей из возможных симметрий — р1. Аналогичное исследование было проведено также цля О-субъединицы 1ва", Кс-АТРаэы [585!. О-Субъединица, как и сам фермент, может быть также получена в виде изолированных мембранных фрагментов, Двухмерные кристаллы формировалис: при медленном (О.! град/ч) ох- !79 лажденни таких мембран от 37 до 4' в среде, содержащей ионы М82+ нли Саз', Следует отмстить, что для кристаллизации 8-субъединицы присутствие ионов ЧО3 необязательно.
Кроме того, эти кристаллы характеризуются болыпей температурной устойчивостью по сравнению с полным фермекголь По данным оптической дифракции и Фурье-анализа разрешение на микрофотографиях достигает 20 гк. Профильтрованные изображения двух кристаллических форм, полученных в присутствии ионов М82+ н Сай+, представлены на рнс.1.53. Элементарные ячейки обоих типов кристаллов содержат по два одинаковых максимума Таблица 1.14 Параметры племектприык ичеек лпзхмериых криетлллеи 81л', К'-АТРлмм Криетялличеекя» форма а, нм Ь, им т, град Л*, им 5,9 7,0 11! 38,5 7,2 12,3 77 86,0 5,6 16,6 89 92,8 ьз — площадь ячейки,а, Ь, т — параметры ялемемтерной ячейки крнсгелли.
плотности (а) и дополнительную область, недоступную для контрастирующего вещества (Ь). (Более подробно это будет рассмотрено прн обсуждении трехмерной структуры кристаллов). Поскольку значения фаз днфракционных максимумов на Фурье-спектрах кристаллов близки к 0 или 180', а на профильтрованных изображениях отчетливо прослеживается наличие поворотной оси второго порядка, то обе формы кристаллов по типу симметрии следует отнести к двухсторонней плоской группе р21. Липидный состав мембран и их физико-химические свойства, повидимому, могут решающим образом повлиять на результаты кристаллизации. Поэтому описанный выше подход не является универсальным.
Так, например, для мембран дисков сетчатки глаза быка, содержащих в качестве основного белка (> 90%) родопсин, применение подобной технологии в широком диапазоне условий (рН, состав среды и т.л.) не привело к образованию кристаллов. Вместе с тем, модификация липндной фазы путем экстракции части липйщов обработкой детергентом Твин-80 аналогично тому, как это было сделано в работе (586), позволила с помощью медленного охлаждения получить кристаллы. Микрофотография и профильтрованное изображение одного из таких кристаллов приведены на рис.
1.54. Кристаллы характеризуются симметрией р4 и их элементарные ячейки (параметры а = гд = 87 тт, у = 90') образованы четырьмя молекулами родопснна, организованными в димеры. Качество таких кристаллов довольно высокое: разрешение 25 тз. Однако их относительное количество не превышает нескольких процентов от общего содержания мембран (587). Для мембранных белков наиболее перспективной является, повидимому, кристаллизация реконструкцией делипидизированного белка 180 р н с. 1.53. Профильтрованные изобразке- инл кристаллов б-суб.ьеиннипЫ 1Ча~, Кв- Атразьь полуученных в присутствии ионов Сна+(а) и Ма т(б) в бислой определенного липндного состава (588, 589].
Широких систематических исследований по двухмерной кристаллизации мембранных белков до настоящсго времени не проведено. Поэтому эмпирический подход все еще является основным. Однако результаты, полученные в ходе изучения нескольких мембранных белков, позволяют выделить ряд факторов, влияющих на формирование кристаллов. В общем случае кристаллизация реконструкцией является более многопараметорным процессом, чем в случае Ъ, К 181 кристаллизации без полной солюбилизации мембран. В зависимости от условий реконструкция белков в липид может приводить к образованию различных структур: много- и однослойных протеолипосом, трубчатых структур, плоских мембран. Наиболее удобны для электронно-микроскопического изучения плоские мембраны.
Необходимо также, чтобы реконструированный в такие мембраны белок имел "плотную упаковку". Для получения требуемых структур определяющими являются выбор липидов и детергента, концентрация белка и количественное соотношение липид/ белок. Так, при использовании "жидких" липидов варьирование этого соотношения может приводить к появлению всего спектра упомянутых выше структур. Для получения кристаллов обычно приходится проводить изучение влияния на характер упаковки белков в мембранах и таких параметров, как рН, ионная сила, наличие многовалентных ионов. В некоторых случаях необходимо также присутствие специфических лигандов, стабилизирующих белок в одном из конформационных состояний.
Существенное влияние могут оказывать также температура и скорость процесса реконструкции, т.е. удаления детергента. Одним из примеров такого подхода может служить исследование процессов реконструкции в липндныс бислои Ргрз-АТРазы (АТР-синтетазы) митохондрий (590, 591). Митохондриальная Р,Рб-АТРаза состоит из двух основных компонентов: мембранной (Ро) и периферической (Р1) частей [5921. Субъединичная топография Р,Ро-АТРазы к настоящему времени практически не изучена, поэтому разработка методов получения всего комплекса в форме мембранных образований, пригодных для таких исследований, является актуальной. Для демонстрации объема работы, которую зачастую приходится проводить в ходе таких Р и с.
!.54. Микрофотографии и картина оптической дифракиии от выбранного участка двухмерного кристалла родопсина Нсгв«нанос «онтрвсгнроввнвс 2%-в им водным рве вором урв- нвввистата исследований, в табл. 1.15 представлены параметры и диапазоны их изменений в экспериментах по реконструкции Е1ро-АТРазы. В результате было установлено, что в зависимости от выбранных условий реконструкции образуются четыре типа белково-липидных структур: протеолипосомы — замкнутые липосомы со встроенными белковыми молекулами (рис. 1.55); мембранные фрагменты — незамкнутые липидные бислои со встроенными белковыми молекулами (рис.!.56); нитевидные структуры — белковые образования, возможно, включающие в свой состав и липидные молекулы, в которых молекулы Е1Еб-АТРазы располагаются преимущественно в одном направлении,образуя нити (рис.
1.57) и двухмерныс кристаллы — плоские липидныс бислои с упорядоченно встроенными молекулами Ггро-АТРазы (рис. 1.58). Кроме того, в препаратах обычно присутствуют отдельные молекулы ГгроАТРазы, фрагменты молекул, чисто липидные мембраны и липосомы, а также аморфный осадок. Содержание подобных образований может 1-3 игал 1-3 мг/мл 0,15 — 0,3% составлять от 20 до 90% от об- Таблица 1.15 щей массы препарата и зависит диаиатоиынэмоноииниарамотровн от чистоты и качества препа- экаворимеитатнорокоисврукиник!каратов белка и липнда, используе- АТРвэы мых при реконструкции, Как правило, исследуемые препараты сопи»натан нам»нанн» держат несколько типов структур, например, протеолипосомы и концснтгвцнл балка мембранные фрагменты одновре- линида менно.
Их относительное содержание зависит от конкретных па- сосгвн буфера длн диалиэа раметров эксперимента по ре- снЗсоонанлитрис-нс! 50-150мм конструкции: соотнопгения липид/ 50 — 1 50 мМ белок/детергент, рН, ионной м с! 5 — 20 мМ !4ан2Р04 силы среды, наличия многова- РН среды З,О-ВД лентных ионов, природы используемых липидов и детергентов, а ТСМИСРатУРа 5-25' также температуры. Продолжительность 12-48 ч В качестве детергента были опробованы: Х, Р(-диметилдодециламино-1»1-оксид (лаурнлдиметиламиноксид, ЛДАО), и-(трет-октил)фениловый эфир полиэтиленгликоля (тритон Х-100), 3-[3-холамидопропил)-диметиламмоний)-пропансульфонат (ЧАПС, фирменное название по первым буквам английского названия детергента) и октил-/)-глюкопиранозид (октнлглюкозид). Оказалось, что использование тритона Х-100 нецелесообразно, так как детергент имеет низкую критическую константу мицеллообразования (- 0,25 мМ) и плохо удаляется диализом.
Поскольку при этом время проведения диализа увеличивается до 48 ч, то происходит частичная денатурация белка, что делает невозможным упорядоченное расположение молекул Р,РО-АТРазы в липидном бислое. В таких условиях образуются только протеолипосомы и мембранные фрагменты. При сокращении времени проведения диализа детергент удаляется неполностью, что приводит к образованию многослойных мембранных структур с расстоянием между слоями около 5 нм. Сравнение характерных размеров таких структур с размерами Р1-АТРазы (12 12.7,4 нм) (593) указывает иа то, что они не содержат молекул Р,РО-АТРазы и их следует отнести к исключительно липиддетсргентным образованиям.
Аналогичные структуры были выявлены и прн проведении реконструкции с ЛДАО, когда детергент удаляется не полностью (через 8-12 ч после начала диализа). По-видимому, отмеченные многослойные структуры являются промежуточными перед образованием как чисто липидных мембранных фрагментов, так и мембранных фрагментов со встроенными молекулами Р1Р0-АТРазы: при последующем понижении концентрации детергента происходит замыкание малых бислойных участков таких структур в единую мембрану н встраивание молекул Р1Р0-АТРазы в липидный матрикс. Более перспективным было использование для реконструкции Р1Р!гАТРазы ЧАПС и октилгликозида, критические 183 Р и с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
