Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Для получения достоверной проекции необходимо усреднить многие изображения молекул, находящихся в одинаковой ориентации. Идеальной в этом отношении является микрофотография регулярно построенного объекта, например, двухмерного кристалла белка, которая содержит фактически много изображений одного и того же повторяющегося элемента (рис.1.46). Главное отличие такого кристалла от обычного трехмерного состоит в том, что его толщина в направлении, перпендикулярном изображению, равна высоте образующих его молекул, т.е.
одной элементарной ячейки. Для получения усредненного профильтрованного от шумов изображения иногда используют оптический дифрактометр (рис. 1.47). Благодаря периодической структуре объекта вся полезная информация о нем содержится в регулярно расположенных дифракционных максимумах. Нерегулярная часть структуры образца — шум — дает дифракциониые максимумы, располагающиеся вне узлов реп1етки. Можно "отфильтровать" шумовую составляющую исходного изображения, используя для формирования изображения только лучи, проходящие через узлы решетки, поместив в плоскость дифракционной картины "маску"— непрозрачный перфорированный экран, пропускающий только эти лучи.
Оптическая фильтрация легко осуществима на практике. Главное ограничение здесь качество перфорированного экрана. "Шумовые" максимумы дифракции иногда располагаются очень близко от основных и поэтому их перекрывание "маской" на практике оказывается невозможным. Наиболее эффективно отфильтровывают изображения периодических объектов с помощью ЭВМ [580]. Для этого участок изображения, используя денситометр, переводят в цифровую форму, превращая его в двухмерный набор оптических плотностей. Затем с помощью преобразования Фурье рассчитывают дифракционную картину от выбранного участка изображения. Как уже отмечалось выше, такой расчет дает как амплитуды, так и фазы дифрагированных лучей. Ее анализ позволяет выбрать наиболее интенсивные и регулярно расположенные максимумы, опираясь на которые можно определить параметры дифракционной решетки и произвести индексирование расположенных в ее узлах максимумов, т.е, приписать им соответствующие индексы Миллера — й и )с".
Для проведения качественной фильтрации надо детально (рис.1.48) проанализировать выбранные дифракционные максимумы, что делают с помощью так называемых е В данном случае третий индекс — !ранен нулю, так как дифракцин получена от плос- кой решетки. 172 Р и с, !.46. Мик офото а роф гр фия участка аысокоупорядоченного даухмерного кристалла цитохром-с-редуктазы и картина оптической дифракции (на астааке е углу) Негатиаисс конг асти алине 1%- р ро . -ным «ахи ым растнором ураннлапстата Калибровка — 0,1 мкм Дифракциониая Объект картина Изображение Р и с. !.47. Схема оптического дифрактометра С, О, 3 — линзы; М вЂ” микрофат ~ — роф аграфия; Р— плсскос1х 11нфракннанной картины; ! — плоскости амплитудных и фазовых спектров (рнс.1.49), которые в цифровой форме подробно показывают распределение таких величин в а узлов об атн й е личин в районах узлов о ратной решетки.
Анализ спектров позволяет определить * центров максимума (и, следовательно, уточнить параметры элементарной ячейки кристаллов), их форму и рассчитать величины амплитуд и фаз (структурных факторов). Используя подученные структурные факторы ддя повторного преобразования Фурье, рассчитывают !73 Р и с. 84К Дифракдионная картина, рассчитанная на ЭВМ с помощью преобразования Фурье, участка изображения двухмерного кристалла»ча~, К+ Атразы символы ЬЭ вЂ” ЬА,В н арэ обозначают разные интенсивности цифрагнраваиных лучей в соответствующих»о»ках обратного нрострвиства.
С»»лог»»н н — б ые л нии — о ратнал ре»песка. проведеннвв через болое интенсивные лифракцнанные л»аксимумы Цифры в углах ещетки— индексы Миллера(Ь и М и в углах рещетки— профильтрованное изображение исходного кристалла, содержащее информацию только о периодической составляющей объекта (рис. 1.50). форПоскольку в каждом дифракционном максимуме содержится инфо— мация о всех элементах структуры изображения, фильтрация дает изображение одной элементарной ячейки кристалла, усредненное по всем ячейкам исходного непрофильтрованного изображения.
Таким образом, статистическая достоверность изображения молекулы достигается автоматически в результате фильтрации благодаря кристаллической природе объекта. Поскольку такие изображения представляют собой проекции трехмерной структуры белков на плоскость, то уже на этом этапе исследования можно сделать некоторые заключения о пространственной организации объекта. Двухмерная кристаллизация белков и проекционная структура кристаллов. Основная трудность в реализации описанного выше подхода состоит в том, что чрезвычайно редко белки рл чрко существуют и функционируют в мембранах в виде двухмерных кристаллов.
Обычно белок необходимо выделить из клетки, очистить до гомогенного состояния и сформировать из него двухмерный кристалл [581). В подавляющем большинстве случаев двухмерной кристаллизации подвергают !74 х ЗО 11 12 13 14 15 16 17 18 32 162 345 179 170 90 57 179 78 42 95 239 253 320 225 211 176 61 84 33 139 367 173 р 254 509 Я95 92 (ЫЗЯЯУ 393 322 Я43 360 128 190 96 91 282 191 242 236 130 49 210 124 166 140 181 89 156 282 105 59 174 121 119 188 36 109 17Я 25 126 Я22 398 193 41 144 16 58 1Я1 152 113 280 125 122 287 164 105 128 ЯВ 53 152 132 216 219 38 39 ЯО х 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 26 22 2 34 17 27 11 ЗЗ ЗЗ 34 2 24 11 ЗО ЗЗ 35 6 17 31 3 34 5 12 22 17 26 36 34 1 10 35 32 31 1 15 Зз З О25 Зг 9 31 13 23 29 18 33 14 ЗЗ 15 19 12 35 22 37 38 18 0 16 12 35 5 24 10 23 39 24 24 25 12 11 3 24 34 5 3 35 1 2 8 26 20 28 17 Р и с.
1.49. Амплитудный (виерху) и фнзовьзй (внизу) спектры учлсгка дифракционной карты вблизи максимума (0,1) на рис 1.48 Верхннл горизонтальна» строке х и полый столбик цифр у — координаты обрлтнаго просгренстел. Центр дифрлкцнанного мзксимумн обведен кругом, цмфры ниутрн прлмоугальннкон — распределение интенсиннасгей и флзоных утлое дифрлгиронениых лучей н непочмлсзлснной близости от центров максимумов 175 интегральные мембранные белки.
Такие кристаллы могут формироваться либо в "нативном" липидном окружении, либо после (в ходе) их реконструкции в липидные бислои подходящего состава. Кристаллизация мембранных белков может быть реализована в том случае, когда белок удается очистить до гомогенного состояния без солюбилизации содержащих его мембран в детергентах. Именно к таким белкам относится Ха+, К'-АТРаза наружного мозгового слоя почек млекопитающих, в частности свиньи. Этот фермент, являющийся натрневым насосом клетки и обеспечивающий создание транс- мембранного градиента концентраций ионов натрия и калия, состоит из двух типов субьединиц а н р, присутствующих в эквимолярных коли- Р н с.
!.50. Проекционная структура двухмерного кристалла цитохром-с-редуктазм, полученная Фурье-фнльтрацнеа участка изображения, аналогичного приведенному на рнс. 146 чествах. Молекулярные массы а- и б-субъединиц составляют 112 и 45 кДа соответственно [5821. При электронном микроскопировании мембранных фрагментов, содержащих очищенную Ха', К'-АТРазу, последняя выявляется в виде хаотично расположенных на поверхности мембран глобулярных частиц. Часто из-за эффектов латсральной диффузии происходит агрегация этих частиц и определенные участки мембраны содержат плотно упакованные молекулы (рис.
1.51). Такая агрегация частиц может быть инициирована внешним воздействием, например, инкубацией мембран при пониженной температуре 15831, В определенных условиях агрегация частиц имеет упорядоченный характер: наблюдается образование цепочек, ассоциация их между собой и формирование микрокристаллических областей. Для формирования двухмерных кристаллов большей площади необходимо тщательно оптимизировать условия крисгаллнзационного эксперимента. 1ча', К'-АТРаза относится к так называемым Е1Ез-ферментам, т.е.
может находиться в двух конформационных состояниях. Для кристаллизации необходимо стабилизировать белок в одной из этих конформаций, что достигается добавлением в среду инкубации соответствующих лигандов. Известно, что анионы ванадиевой и фосфорной кислот стабилизируют Ха', К'-АТРазу в кон- 176 Р н с. !5 !. Микрофотографии мембранных фрагментов Р!а+, Кг-АТРазы в — агрегированные мовокульи 6-д — агрсгация малскул с ггбразованисм цепочек, рялоп и крисгалличсскик областей небольшого раямсра: г — лвухмсрный «рисгалл и оптическая лифракция пт иыбранногп у метка изображения !77 формации Еь Этому эффекту способствует присутствие ионов калия в высокой концентрации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
