Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Появились микроскопы, позволяющие проводить съемки при низких и сверхнизких температурах, что уменьшает радиационное повреждение биологических объектов. Расширился диапазон ускоряющих напряжений и созданы электронные устройства, минимизирующие облучение образца. С другой стороны, благодаря развитию вычислительной техники появился целый спектр методов цифровой обработки изображений. Применение компьютеров позволяет по-новому подойти к проблеме увеличения контрастности изображений и перейти к трехмерной электронной микроскопии, т.е. синтезированию пространственных изображений исследуемых объектов на основе нх проекций.
Яркой демонстрацией возможностей современной электронной микроскопии является установление пространственной структуры бактериородопсина первоначально с разрешением — 7 А, а впоследствии — 3 А. Это означает, что электронно-микроскопические методы могут в отдельных случаях приближаться по своей информативности к рентгеноструктурному анализу.
б.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА Теоретические принципы, лежащие в основе световой микроскопии, справедливы н для электронной, а электронный микроскоп во многих отношениях аналогичен световому. Длина волны электронного пучка зависит от величины ускоряющего напряжения. Так, при 50 кВ она равна 0,054 А, а при 1000 к — 0,0087 А, т.е, короче рентгеновского излучения и поэтому можно было бы ожидать, что такой микроскоп будет давать изображение с большим разрешением по сравнению с рентгеновской дифракцией.
Однако по техническим причинам это неосуществимо н лучшие современные электронные микроскопы дают разрешение - 2,0 А. з Электроны обладают более разруююнльным действием на сравненню с рентгеновским излучением. Минимальные дозы облучения, необходимые длн регистрации изображения, в тысхчн раз нревын~ают дозы рентгеновского излучения, необходимые длл регистрации днфракцнн, например, от белковых крнсткхлов. 1бе Р и с.
144. Расположение электромагнит- ных линз в злектронном микроскопе Отрицательное смещение ое нвпрпжение от 40 до !Об кв Линза и апертура объектива Промежуточное изображение Промежуточный флу— проецирующий зкрал Провкционнаи линза !бц Контрастность изображения. Од- ~ — Экран ной нз острых проблем электронной микроскопии биологических онденсорнаи линза и объектов является контраст- пертура кондвнсора ность нзображеннй, Нет смысла стремиться к высокому разреше- Б нню, если детали изображения нельзя различить нз-за низкой контрастности.
В обычной просвечнвающей электронной мик- проектор роскопнн (рнс. 1.44) изображение формируется электронами, упруго рассеянными атомами образца. Если какой-то участок образца содержит скопление тяжелых атомов, часть электронов рассенвается под большими углами, онн задерживаются объективной апертурой (днафрагмой) н на флуоресцентном экране такой участок выглядит темным. Та часть образца, которая образована легкими атомами, рассеивает электроны слабо, электроны фокуснруются линзой н на изображении этот участок будет, соответственно, светлее. Апертура является важным элементом конструкцнн микроскопа н играет двоякую роль: она пропускает только те лучи, которые почти параллельны оптической осн н могут быть сфокуснрованы линзой, н, задерживая электроны, рассеянные под большими углами, увеличивает контрастность изображения.
Такой механнзм образования контраста называется амплитудным. Другой способ увеличения контрастности изображения связан с расфокуснровкой изображения — фазовый контраст. На участках образца, имеющих резкое изменение толщины нлн плотности вещества нз-за ннтерференцнонных эффектов в условиях расфокуснровкн нзображення, возникают так называемые полосы нлн кольца Френеля. Если сделать серию снимков, проходя от "недофокуснрованных" нзображеннй к "перефокуснрованным", можно легко убедиться, что по обе стороны от *'острого" фокуса снимки будут более контрастными. Такой способ увеличения контрастности изображений широко используется на практике..Однако необходимо быть осторожным, так как чрезмерная расфокуснровка приводит к потере разрешения н появлению ложных деталей изображения.
Специфика биологических объектов в отношении контрастнровання состоит в том, что онн в основном построены нз легких элементов н для мнкроскопнровання помещаются на тонкнс угольные нлн полимерные пленки. Различие в рассенвающейспособностн образца н пленки под- ложки мало, и, следовательно, контраст изображения низок. Поэтому чаще всего биологические объекты приходится окрашивать красителями, содержащими соли тяжелых металлов.
Окрашивание неизбежно приводит к значительному снижению разрешенил, а также, по-видимому, и к некоторому изменению структуры объектов. Для окрашивання или контрастирования биологических объектов разработано много методов. При изучении макромолекул и надмолекулярных образований часто применяют так называемое негативное контрастирование, при котором исследуемые частицы заключают в тонкий слой электронно-плотного Слой контрастера Р и с. 045.
Негативное контрастирование Подложка вещества. Такое контрастирование называют негативным, поскольку электронно-плотное вещество не "окрашивает" объект, а заполняет пустоты н контрастирует его границы (рис, 1.45). Это название, разумеется, условно, ибо всегда происходит н позитивное прокрашиванне и необходимо выбрать методику так, чтобы упомянутый эффект был минимальным. В качестве контрастеров часто применяют соли урана и фосфовольфрамовую кислоту. Описанная выше процедура преследует две цели: увеличение контрастности изображения и предотвращение разрушения образца при бомбардировке электронами.
В сущности при микроскопировании исследуются не сами биологические структуры, а "слепки" с них. При негативном контрастировании фактически изучаются особенности распределения контрастирующего вещества, обусловленные структурой объекта. Поэтому в изображения объектов существенный вклад могут вносить особенности распределения контраста, собственная структура контрастирующего вещества (аналогично зернистости эмульсии фотоснимка), ограничивающая предельное разрешение, и искажения структуры, Понимание особенностей методики подготовки образца, как процесса "отображения'* структуры, необходимо для правильной интерпретации электронно- микроскопических изображений. Трехмерная электронная микроскопия.
Любое изображение, полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии, представляет собой двухмерную проекцию структуры трехмерного объекта на плоскость. Поэтому такое изображение не содержит всей информации о трехмерной структуре. Вместе с тем, если иметь серию подобных проекций, полученных при съемке образца под разными углами, например, наклоном его относительно оптической оси микроскопа, можно достаточно полно представить пространственную структуру объекта. В принципе эта процедура аналогична рассматриванию любого предмета с разных углов зрения. Задачей трехмерной электронной микроскопии является реконструкция пространсгвенной структуры 170 на основе набора двухмерных проекций, полученных при съемке объекта под разными углами.
Метод реконструкции может быть основан на хорошо знакомой из кристаллографии теореме проектирования, согласно которой двухмерная Фурье-трансформанта трехмерного распределения плотности (т.е. объекта) идентична центральному сечению трехмерной трансформанты, нормальному к направлению проектирования. Поэтому трехмерную Фурье-трансформанту объекта строят последовательно сечение за сечением, используя преобразования для различных направлений проектирования. Другими словами, применяя Фурье-трансформанты проекций, снятых под разными углами, можно построить трехмерную трансформанту объекта.
Реконструкцию трехмерной структуры объекта получают повторным преобразованием Фурье-трансформанты подобно тому, как это делается при расчете трехмерной структуры в рентгеновской кристаллографии. Принципиальное отличие состоит лишь в том, что экспериментальными данными здесь являются не дифракционныс картины, а изображения.
Трансформанты изображений (проекций) получают путем математической операции двухмерного преобразования Фурье, в результате которого рассчитываются не только амплитуды, но и фазы структурных факторов. Поэтому для реконструкции трехмерной структуры задачи решения фазовой проблемы не возникает'. Описанный подход к реконструкции трехмерной структуры требует превращения изображений в цифровую форму — двухмерную карту распределения оптической плотности и его последующего цифрового "процессинга'*, например, преобразования Фурье с помощью ЭВМ. Начало развитию методов трехмерной электронной микроскопии было положено работой Д.
Де-Розира и А. Клуга ~577, 578), которые впервые применили цифровой процессинг изображений для изучения пространственной структуры бактериофага Т4. То обстоятельство, что благодаря высокой степени симметрии объекта многие наклонные проекции оказались идентичными, позволило рассчитать его структуру на основании единственного электронно-микроскопического снимкаб. Для менее симметричных структур требуется большее количество проекций. Так, в случае экосаэдрических вирусов тем же авторам понадобилось объединить информацию, содержащуюся в трех снимках ~579].
Большинство объектов исследования не обладает высокой собственной симметрией. Поэтому для реконструкции трехмерной структуры приходится собирать большие наборы их изображений, снятых с помощью электронного микроскопа в максимально широком диапазоне углов. 4 В том смысле, что экспериментальные даннью уже содержат информацию о фазах.
Однако проблема правильного и точного определения параметров существует всегда. 5 Для иллкклрации идентичности проекций симметричных объектов можно рассмотреть предельный случай симметричности — шар, любые проекции которого идентичны друг другу. 17! 6.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ПЕРИОДИЧЕСКИХ СТРУКТУР Обычно электронно-микроскопические изображения характеризуются высокой степенью *'зашумленности". Поэтому одинаковые проекции структуры молекул отличаются друг от друга различным прокрашиванием, зернистосгью пленки-подложки, частичным искажением структуры и т.п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
