Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Если до недавнего времени рентгеноструктурный анализ являлся фактически единственным прямым методом исследования нативных конформаций белковых молекул с атомным разрешением, то сейчас он становится источником 1также единственным) столь же детальной информации о пространственном строении промежуточных соединений.
Таким образом, ближайшие перспективы развития рентгеноструктурного анализа белков будут определяться достижениями в использовании сннхротронной радиации в трех отмеченных направлениях: синтезе н кристаллизации белков, а также условиях проведения эксперимента. Продолжится наметившееся сближение рентгеноструктурного анализа белка с методами малоуглового рассеяния, флюоресценции, крномикроскопии, лазерной, ЯМР- н Уф-спектроскопии и т.д. Сделанные прогнозы касаются кумулятивного развития кристаллографии белка н, следовательно, говорят о его тактических целях.
Что жс касается стратегического прогноза, то он не может быть известен, поскольку развитие науки, являясь нелинейным неравновесным процессом, не имеет конечной цели и непредсказуемо в принципе. Глава 5 НЕЙТРОННАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ БЕЛКОВ Два десятилетия (1960 — 1970-е годы) рентгеноструктурный анализ был единственным методом прямого исследования пространственного строения белков. Его роль и сейчас остается доминирующей. Однако в начале 1980-х годов появились новые методы, дополняющие рентгеноструктурный анализ. Они основаны на применении в кристаллографии белков дифракции нейтронов и гамма-лучей.
Эти методы сходны с рентгеноструктурным анализом прежде всего использованием одного и того же состояния исследуемого образца — это также белковый монокристалл и изучаемым явлением — дифракцией, но дифракцией уже других излучений. Явления, происходящие во взаимодействии атомов, упорядоченных в кристаллической решетке молекул белков, с нейтронами н гамма-излучением, сильно отличаются друг от друга и от того, что имеет место при взаимодействии атомов с рентгеновским излучением. Поэтому получаемые от трех методов дифракционные картины не полностью совпадают между собой, а дополняют друг друга, раскрывая новые свойства белковых молекул.
Рентгеновские лучи рассеиваются электронной плотностью. Рассеивакицая 1ЬЗ способность разных атомов существенно различается: у атомов водорода она в десятки раз меньше, чем у атомов углерода, азота, кислорода, а сотни раз меньше, чем у атомов фосфора, серы, хлора и в тысячи раз, чем у тяжелых атомов (платины, золота, ртути, урана). Поэтому в рентгеноструктурном анализе даже при высоком разрешении практически нельзя определить координаты атомов водорода, которые составляют около половины всех атомов белковой молекулы.
Нейтроны рассеиваются ядрами атомов, т.е, совершенно иным образом. Размеры ядер, причем ядер всех элементов, чрезвычайно Таблица 7!2 расееаиие иеатреиеа ратличимаш атомами !0-33 Атом 3, Н3-!3 Атом -3,74 б,б7 б,б5 9,40 и О С Х О Б Са 5,80 2,80 4,70 1б5 малы по сравнению с длиной волны нейтрона (нспользуют потоки нейтронов с длиной волны, соизмеримой с длиной валентных связей), поэтому все атомы рассеивают нейтроны примерно одинаково.
В табл. В!2 приведены данные о рассеянии нейтронов, полученные для различных атомов [рассеивающая способность охарактеризована амплитудой рассеяния (Ь), которая в зависимости от спина ядра, если он не равен нулю, может иметь два значения (Ь' и Ь-)], Атомы водорода, не поддающиеся локализации при использовании метода рентгеноструктурного анализа, могут быть легко привнесены в найденную трехмерную структуру белка с помощью хорошо известных стереохимических правил. Такая процедура проводится автоматически на ЭВМ. Однако есть случаи, когда знание положений атомов водорода в молекулярной структуре имеет принципиальное значение и должно быть получено опытным путем.
Как правило, это касается активных центров ферментов, где установление конкретных систем водородных связей очень важно, поскольку они играют определенную функциональную роль. В решении подобного вопроса необходимо рентгеноструктурный анализ дополнить изучением дифракции нейтронов. Возмозкность наблюдать положения водородных атомов значительно расширяет круг решаемых кристаллографией задач, Доступными для изучения становятся некоторые динамические аспекты пространственной организации белков, в частности конформационные флуктуации белковых молекул.
В этом отношении одной из перспективных областей применения нейтронной техники является получение качественной информации о процессе замещения водорода на дейтерий, атомы которого по-другому проявляют себя в рассеивании нейтронов. В 1950-е годы А. Гвндт и К. Линдерстрем-Ланг впервые использовали метод Н/В-замены для изучения конформационной динамики белковых молекул [568[. Он основывался на определении скоростей изотопного обмена протонов амидных групп в нативных белках.
Различие в скоростях, достигавшее 8 — 10 порядков, коррелировалось с доступностью обменивающегося протона, т.е, с положением амидной группы в трехмерной структуре белка. То, что обмен водорода на дейтерий совершался [хотя и медленно) даже у амидных групп, находящихся в центре глобулы и не имеющих непосредственных контактов с окружающей средой, было объяснено конформационной лабильностью белковой молекулы, ее "дыханием". В последние годы интерес к изучению динамических свойств белков заметно возрос, и нейтронная дифракция может оказаться чрезвычайно ценным методом для получения строго количественной структурной информации.
Используемые ранее методы были не в состоянии устанавливать непосредственную связь между скоростью замещения Н/]) и положением соответствующих групп в белковой глобуле. Тем самым выводы о механизме конформационных флуктуаций неизбежно носили феноменологический характер, что ограничивало понимание причин, вызывающих это явление. Первый, кто обратил внимание на большие возможности нейтронной дифрации в Н/В-анализе, был Б. Шенборн [1971 г,) [569 — 571]. В настоящее время с помощью такой техники исследованы процессы замещения амидных водородов в миоглобине, рнбонуклеазе, трипсине и крамбине.
Это были самые первые работы такого плана. Но они позволили усгановить новые фактьп причем при анализе объектов, которые ранее уже были тщательно изучены другими методами. Например, при исследовании изотопного замещения рибонуклеазы А было обнаружено различное отнесение мест замещения, даваемое нейтронным анализом, химическими методами и использованием тритиевой замены. Установлено, что количественные результаты химического анализа, полученные для рибонуклеазы 8, лишенной первых 20 остатков [пептида 8), не могут быть перенесены на целый белок — рибонуклеазу А. Особенно интересны данные нейтронной дифрации по Н/О-замене в трипсине, полученные А.
Козиаковым [572, 573]. Они противоречат общепринятой трактовке обмена изотопов путем глобального кооперативного развертывания пептидной цепи. Не менее плодотворна нейтронная дифракция в изучении частично и полностью связанных молекул воды в пограничном слое и внутри белковой глобулы. Детальный анализ структуры водного окружения белка с помощью нейтронов впервые провели Б. Шенборн и Дж. Хенсон [574].
Они обнаружили значительное расхождение в наборах из 40 прочно связанных молекул воды с исследованным ими СО-миоглобином и исследованным Т. Такано метмиоглобином методом рентгеноструктурного анализа [575]. Надежная фиксация положений атомов водорода при нейтронной дифракции делает этот метод уникальным в изучении внутренних вращений вокруг одинарных связей, особенно вращений метильных групп. Из карт нейтронной плотности трипсина следует, что, несмотря на плотную упаковку бслковой макромолекулы, 166 подавляющее большинство метильных групп (свыше 85%) находится в ориентациях, отвечающих минимумам торсионного потенциала. Рентгеноструктурный анализ усложняется тем, что рентгеновские лучи являются ионизирующим излучением, что приводит при нормальной температуре к быстрому разрушению кристалла.
Это обстоятельство требует частой замены экспонируемого образца и введения при обработке опытных данных специальных поправок, ведущих к дополнительным ошибкам. Нейтроны — незаряженные частицы. В дифракционных экспериментах длина волны нейтронного потока должна быть того же порядка, что и длины валентных связей. В рентгеноструктурном анализе обычно используют медное излучение с Х = 1,54 А. Нейтроны с длинами волн такого порядка испускаются при температуре -100' и называются тепловыми. Онн имеют значительно более низкую энергию (0,025 эВ) по сравнению с рентгеновским излучением (10 000 эВ) и не разрушают кристаллы белков, поэтому набор дифракционных данных для нейтронов можно получить от одного кристалла, что является несомненным достоинством метода.
Недостаток метода нейтронной дифракции — малая интенсивность потока частиц. Распределение скоростей нейтронов, из которого вырезается мочохроматический поток, отвечает кривой Максвелла. Интенсивность первичного потока нейтронов по крайней мере на два порядка слабее характеристического излучения рентгеновской трубки. Вь|ше отмечалось, что способность атомов рассеивать нейтроны существенно не зависит от порядкового номера в Периодической системе элементов Менделеева. Поэтому метод изоморфного замещения с использованием тяжелых атомов бесполезен в нейтроноструктурном анализе белков, Альтернативный подход к решению фазовой проблемы еще не найден. В связи с этим для расшифровки нейтронограмм необходимо использовать данные ренттеноструктурного анализа. К настоящему времени с помощью метода нейтронной дифракции в комбинации с рентгеноструктурным анализом получены полные трехмерные структуры следующих пяти белков: трипсина, лизоцима, миоглобина, рибонуклеазы и крамбина (разрешение 2,2; 2,2; 1,4; 2,8 и 1,3 А соответственно; ошибка в определении координат < 0,3 А) (548].
Глава 6 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ БЕЛКОВ Одним из методов, позволяющих получать важную структурную информацию, является электронная микроскопия (576). Этот метод больше других способствовал пониманию клеточной морфологии и структуры клеточных органелл.
Возможность получения непосредственного изображения с большим увеличением широко используется почти во всех областях биологии н материаловедения. Однако метод имеет ряд ограничений, особенно в случае применения его к биологичсским объектам. Во-первых, реальное разрешение на биологических объектах обычно не превышает — 15 А, хотя предельное разрешение современных электронных микроскопов достигает величины - 2,0 А.
Во-вторых, прн исследовании макромолекул серьезные трудности связаны с контрастностью образцов и их стабильностью в условиях глубокого вакуума и облучения пучком ускоренных электроновз. Кроме того любое электронно-микроскопическое изображение представляет собой двухмерную проекцию трехмерного объекта на плоскость фотопластинки. В последние годы электронная микроскопия молекулярных уровней разрешения бурно развивается. С одной стороны, непрерывно совершенствуется приборная база.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
