Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 40
Текст из файла (страница 40)
[559). В 1957 г. Д. Кови и Г. Коэн обнаружили, что ауксотрофные клетки Е. со[1, утратившие способность синтезировать метионин, могут успешно развиваться и давать не менее ста генераций при добавлении в питательную среду селенометионина [560). Тем самым было показано, что необходимые для поддержания жизни Е, со11 белки, в которых все остатки Ме~ заменены на Яе-Мед продолжают функционировать нормально. Позже эти результаты были подтверждены Д.Ле Мастером, который целенаправленно создал ауксотрофный для метионина клон путем повреждения МезА гена [561].
Появилась возможность производить синтез аминокислотных последовательностей Е. со11, в которых на всех местах, где положено быть остаткам Мед находятся остатки Бе-Меь Развивая это направление, Хендриксон и соавт. [559) разработали метод встраивания остатков Яе-Ме1 в рекомбинапгные белки, продуцированные плазмидами Е. со16 Предшествующие исследования авторов пространственного строения молекул селенолантионина [557] и селенобиотинилстрептавидина [556] с применением МАД- фазирования показали, что атом Яе является эффективным центром аномального рассеяния.
Поэтому можно сказать, что предложенный метод встраивания остатков селенометионина в положения метионина станет универсальным подходом для белков, особенно тех, которые не содержат в своем нативном состоянии естественных резонаторов. ' Авторы метода использовали его для получения двух тиоредоксинов клеток Т4 и Е. со11 со стопроцентной заменой метионина на селенометионин. Кристаллы [эе-Ме1]-замещенных тиоредоксинов оказались полносп,ю изоморфными природным рекомбинантным белкам. Дифрак- 160 Р и с. Е43, Факторы аномального рассеяния Г, Г кристалла селенометиониноаого тнорелоксина Е.
соБ, измеренные вблизи края ноглолзения селена в й р Элсктрн гсскна сектор Е сннк- ротро нного рентгеновского нзлу- нсннл параллелен гкн л крис- талле 4рр г ргг ярг, арр лгллла ллллег, А ционные измерения выполнены при трех отобранных длинах волн синхротронной радиации. Одна длина волны соответствовала минимальной энергии аномального рассеяния (у ' „), вторая максимальной энергии поглощения (у",„), а третья длина волны находилась вдали от полосы электронного перехода атома Яе и, следовательно, отвечала фактору нормального рассеяния об).На рис.1.43 приведены зависимости факторов аномального рассеяния у' иу"'от облучаемой длины волны, полученные при одной ориентации кристалла 15е-МеЦ-тиоредоксина Б.
со!й Высокая чувствительность~'и1"'к изменению длины волны в области 0,98 А и четко выраженный краевой эффект указывают на большие возможности метода МАД в решении фазовой проблемы. Первоначально фазы находятся для нескольких аномально рассеивающих центров, а затем на этой основе — для всех неводородных атомов белка 15621. Таким образом, к началу 1990-х годов внутренние проблемы метода мультидлинноволновой аномальной дифракции были в основном решены. Он обрел форму, требуемую для его широкого применения в рентгеноструктурном анализе белков.
Метод МАД имел прочный теоретический фундамент, был детально разработан в экспериментальном и препаративном отношении, оснащен всеми программами, необходимыми для обработки дифракционных данных, построения карт электронной плотности и расчета координат атомов пространственной структуры белковой молекулы. К этому времени его уровень в научно-методологическом плане, приборном обеспечении, степени математического формализма, разрешающей способности и надежности результатов оказался не ниже уровня метода мультиплетного изоморфного замещения тяжелыми атомами.
Тем самым более очевидными выступили преимущества МАД, хотя по ряду причин, но главным образом в силу инерции, используемый десятилетиями метод МИЗ не скоро уступит свое место, 6. Проблема белка, т, 2 161 Быстрое признание нашел метод Хендриксона в синтезе селенометиониновых производных белков. В работах последних лет кристаллы таких белков часто служат для получения дифракционных картин одновременно от аномального рассеяния, используя при этом резонансные длины волн, и от нормального рассеяния, рассматривая селен как тяжелый атом. Именно такой является работа В.
Рамакришнана и соавт., в которой определена с разрешением 2,5 А трехмерная структура глобулярного домена лннкерного гистона Н5 [512], [Яе-Ме1]-производное домена синтезировано методами генной инженерии. Выращенные из него кристаллы полностью изоморфны кристаллам нативного белка. Для фазирования применены методы МАД и МИЗ. Авторы отметили, что обработка данных, выполненная традиционным способом в комбинации с недавно предложенной процедурой уточнения параметров тяжелых атомов, названной методом максимальной вероятности, илн максимального подобия [563, 564], привела к более предпочтительным картам электронной плотности, чем способ Хендриксона и соавт., за которым закрепилось название алгебраического метода [558). М.
Ньюмен н соавт. [565] с разрешением 1,95 А установили кристаллическую структуру рестрикционной эцдонуклеазы ВашН1, состоящей из 213 аминокислотных остатков. Авторы обратились к использованию селенометионинового варианта после того, как безрезультатными оказались попытки интерпретировать карту Паттерсона, которая была построена по данным, измеренным для нескольких белковых производных тяжелых атомов.
[Яе-Ме1]-эндонуклеаза экспрессирована в ауксотрофных клетках Е. со11, выращенных в среде, включающей наряду с! 9 стандартными аминокислотами селенометнонин вместо метионина [559]. Полученный таким образом объект исследования не отличался своей активностью от нативного фермента, а его кристаллы были полностью изоморфны кристаллическому состоянию последнего.
Методологическая новизна этой работы заключается в том, что установление пространственной структуры эндонуклеазы осуществлено путем комбинации фазовой информации, заключенной в данных аномальной дифракции, полученной методом максимальной вероятности и алгебраическим методом [558, 563, 564]. И тот, и другой приводят приблизительно к одинаковым фазовым ошибкам по отношению к фазам уточненной модели. Авторы полагают, что усредненные фазы значительно ближе к истине, чем полученные одним из методов. Кристаллы [Бе-Ме1]-ВашН! при температуре 5' облучались тремя длинами волн, отвечающих куаю [0,979 А) поглощения Бе и удаленной области спектра [0,900 А). Гонадотропин зародыша человека, структура которого была определена Хендриксоном и соавт., является гликопротеиновым гормоном плаценты [237 аминокислотных остатков), стимулирующим секрецию поддерживающего беременность стероидного гормона прогестерона [566].
Как рекомбинантный [Яе-Ме1]-белок, он был синтезирован в клетках яичника хомяка. Этот несколько неожиданный факт свидетельствует, что эукариотические клетки млекопитающих могут быть столь же высоко толерантны, как н прокариотнческие клетки Е. со!1, к пол- 162 ному замещению метионина на селенометионин. Уровень замещения в данной работе составил 92%. Структура гонадотропина после частичного дегликозилирования идентифицирована с разрешением 2,6 А.
Использовались дифракционные данные, полученные методом МАД, Кристаллический образец облучался четырьмя длинами волн синхротронной радиации. Две из них (- 0,98 А) находились на краю и пике поглощения Яе, а две другие в стороне от полосы поглощения. Для каждой длины волны были получены ориентировочные значения дисперснонной 1)') и абсорбционной Ц ) компонент аномального рассеяния. В работе Дж. Смит и соавт. метод МАД использован для определения пространственной структуры регуляторного аллостерического фермента глугамин-5-фосфорибозил-1-пирофосфат (РРРР)-аминотрансферазы 1567).
Белок состоит из 465 аминокислотных остатков н атома Ре, который является аномально рассеивающим центром при облучении тремя длинами волн (1,7425, 1,7390 и 1,5000 А) синхротронного излучения. В кристалле РкРР-амннотрансфераза обнаружена в виде гомотетрамера (молекулярная масса -200 кДа). В предшествующих рентгеноструктурных анализах с применением метода аномальной дифракции объектами исследования были белки, молекулярные массы которых не превышали 30 кДа.
Данная работа свидетельствует о больших возможностях МАД в определении трехмерных структур громоздких белковых комплексов. Рассмотренные в этой главе исследования, по-видимому, не оставляют сомнений в том, что в 1990-е годы рентгеноструктурный анализ белков, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, приступил к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии.
Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного изменения возможностей кристаллографии макромолекул связана с использованием синхротронной радиации. Переход к новому источнику рентгеновского излучения, во-первых, ослабляет требования, предъявляемые к размерам кристаллов, что особенно важно в структурном анализе высокомолекулярных белков и их комплексов, имеющих крупные элементарные ячейки. Во-вторых, сплошной спектр синхротронной радиации и легкость выбора любой длины волны монохроматического излучения дали возможность по-новому подойти к решению фазовой проблемы и разработать метод мультидлинноволновой аномальной дифракции, требующий для фазирования одного кристаллического образца.
Существенным дополнением метода МАД стал способ рекомбинантного получения в ауксотрофных клетках белков, в аминокислотных последовательностях которых все остатки метионина заменены на селенометионин. Использование [Зе-Ме[) белков не только освобождает рентгеноструктурный анализ от длительной рутинной процедуры приготовления нескольких изоморфных белковых производных тяжелых атомов, но практически снимает саму проблему изоморфизма. 163 И наконец, в-третьих, самое важное, применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, несравненно более мощной, чем излучение рентгеновской трубки, снижает по крайней мере на два-трв порядка время экспозиции. Значение этого факта трудно переоценить, так как становятся доступными для установления трехмерных структур на атомном уровне промежуточные соединения процессов жизнедеятельности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
