Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 39

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 39)

Метод определения фаз с помощью тяжелых атомов, получивший название мультиплетного изоморфного замещения (МИЗ), впервые был 156 ьпробован в 1954 г. Перутцем и совет. в исследовании кристаллограичрической структуры гемоглобина ~549). До самого последнего времени ои оставался практически единственным подходом к расчету требуемых фазовых углов. Все эти годы, однако, не прекращался поиск альтернативного подхода, поскольку метод МИЗ весьма далек от совершенства. Поиск необходимых производных строится путем "проб и ошибок" и в каждом отдельном случае требует доказательства того, что присоединение тяжелых атомов не вызывает искажений в структуре белковой молекулы, т.е. действительно является изоморфным. Подтверждение изоморфизма не всегда возможно, поскольку не все нарушения можно выявить без предварительного знания структуры кристалла нативного белка.

Трудности эксперимента, сопутствующие применению метода изоморфного замещения, сказываются на чисто научной стороне исследования, сужая спектр решаемых задач. Различия в интенсивностях пучков дифракционного рассеяния, вызванные введением в кристаллическую решетку молекул белка тяжелых атомов, могут быть обусловлены не только вкладами от вынужденных колебаний электронов этих атомов, т.е. нормальным рассеянием рентгеновских лучей.

Помимо этого, при определенных условиях, рассматриваемых ниже, изменения в интенсивностях рефлексов могут возникать в результате так называемого аномального рассеяния. Классическая теория данного явления была развита еще в 1933 г. Г. Хенлом )550). В трактовке дифракции рентгеновских лучей кристаллами белка и его изоморфных производных предполагается, что принадлежащие атомам электроны являются свободными и в таком состоянии приводятся в вынужденные колебания с частотой ю, равной частоте первичного рентгеновского излучения.

Амплитуда нормального, упругого рассеяния ))е(В)) зависит от брэгговского угла (В), определяющего направление в пространстве дифрагированного луча, но не зависит от длины волны (Х). В общем случае это предположение некорректно, поскольку электроны в атомах не являются свободными, а взаимодействуют, особенно эффективно на внутренних К- и Е-орбиталях, с ядром и друг с другом. В классической теории рассеивающие атомные центры рассматриваются наборами дипольных осцилляторов, имеющих собственные частоты колебаний (ы,), которые равны частотам поглощаемого атомом электромагнитного излучения.

Когда частота падающей волны значительно отличается от частот собственных колебаний электронов (н Х> кч или ы ( ы,), интенсивность дифрагированного луча практически полностью определяется нормальным рассеянием, и поэтому поглощением обычно пренебрегают, т.е. считают ы, = О. Однако если частота рентгеновского излучения становится сопоставимой с частотами собственных колебаний электронов (ю — ш,), возникает резонанс, изменяющий амплитуду и фазу рассеяния. Имеет место аномальное рассеяние.

Фактор аномального рассеяния ф(Х)), связанный только с резонансным эффектом, мало чувствителен к величине угла рассеяния, но 157 сильно зависит от длины волны облучаемой радиации, т.е. обнаруживает заметную дисперсию волн. Фактор)а[Л) является комплексной величиной )веп Ж вЂ” коэффициент затухания) и содержит вещественную дисперсную компоненту аномального рассеяния (Д') н мнимую абсорбционную компоненту аномального рассеяния (г'). Абсолютная величина ]' пропорцвональиа коэффициенту поглощения, поэтому она приобретает большее значение, когда падающая частота близка к краю поглощения, Таким образом, общее рассеяние представляет собой сумму факторов нормального и аномального рассеяния: Р[е) +Р[л) =Ме, л).

Фактор Р(Л) включает два компонента, и поэтому в общем случае можно написать: у=]а+яви=/с ~~'+[", Кристаллическая решетка белков, не содержащих аномально рассеивающих центров, дифрагирует рентгеновские лучи от обычной трубки с медным анодом нормально. Аномальное рассеяние в этом случае отсутствует, так как частоты собственных колебаний ы, атомов Н, С, Х, О и Б весьма далеки от частоты и К,-излучения для возникновения резонанса. Общая двфракция белкового кристалла, обладающего аномально рассеивающими центрами, описывается для каждого измеренного рефлекса структурным фактором "Е,(6).

Он включает нормальную часть — "г'г[Л), состоящую из рассеивающих компонент от всех атомов структуры белка, н аномальную часть. Последняя равна произведению нормальных компонент аномально рассеивающих центров ["Рл(Ь)] на отношение факторов аномального к нормальному рассеянию — Р(Л)//е(0). Следовательно, хр [й) ол [й) ел ® в[Л)~о[~) Дж. Карле в !980 г. [551] и позднее У.

Хендриксоном [552] было показано, что прецессионные измерения всех дифракционных рефлексов от одного кристаллического белкового образца с аномальным рассеянием, полученным при нескольких (3 — 5) длинах волн рентгеновского излучения, позволяют по набору экспериментальных данных ] "Е ] рассчитать вещественные составляющие факторов |"Рг~', ~'Т„~ и а о Ьчз — ~рг — <р„, Значения ~ 'Ж„] используют для определения пространственного расположения центров аномального рассеяния, и на этой основе рассчитывают сначала значения Ф'„, а затем, зная Ь~р", значения а 'Рг Таким образом. фазовая проблема может быть решена и без привлечения метода мультиплетного изоморфного замещения. Однако цена такого решения долгое время оставалась слишком обременительной для того, чтобы новый подход нашел широкое применение. Хотя он и достигал той же, что и метод МИЗ, цели, причем делал это при использовании не нескольких, а лишь одного белкового кристалла, тем не менее требовал соблюдения по крайней мере двух трудновыполнимых условий.

Во-первых, исследуемый образец должен содержать аномально рассеивающие атомы, которых в нативном белке может не оказаться. Во-вторых, для оптимизации эффекта аномального рассеяния необходим непрерывно настраиваемый на разные длины волн с высокой точносп ю и в широком спектральном диапазоне источник рентгеновского излучения. Первое условие не ведет к дополнительным осложнениям лишь в случае металлопротеинов, а второе требует полихроматической радиации н, следовательно, практически исключает применения рентгеновских трубок. В настоящее время отмеченные трудности метода мультидлинноволновой аномальной дифракции (МАД) в основном преодолены, что будет ясно из последующего изложения, и решающую роль начинают играть его очевидные преимущества перед традиционным подходом к решению фазовой проблемы (МИЗ).

Число публикаций, посвященных рентгеноструктурному анализу белков с использованием МАД, растет и в ближайшем будущем этот процесс, по-видимому, приобретет лавинообразный характер. В первый раз монополия в рентгеновской кристаллографии белков изоморфного замещения была нарушена в 1981 г., когда У. Хендриксону и М. Титеру удалось установить атомную трехмерную структуру крамбина по дифракционной картине одного кристаллического образца [553). Проблема фаз была решена методом МАД при использовании трех длин волн синхротронного излучения и аномального рассеяния атомов серы остатков метионина, входящих в аминокислотную последовательность белка.

Стало очевидно, что синхротронная радиация может сделать МАД мощным инструментом исследования структуры белков,Не в полной мере, однако, удовлетворяло использование серы в качестве аномально рассеивающего центра. Дисперсионный и абсорбционный компоненты (1', ~'") фактора аномального рассеяния серы значительно уступают величине нормального компонента структурного фактора и во много раз меньше соответствующих величин компонентов аномального рассеяния более тяжелых атомов. Поэтому в последующем рентгеноструктурном анализе белков с помощью МАД от использования серы как аномально рассеивающего центра пришлось отказаться.

Объектами исследования стали белки, содержащие в нативном состоянии атомы металлов (ге, 7п, Сп и др.), и изоморфные тяжелоатомные производные белков, как в методе МИЗ. Вслед за крамбином, используя аномальное рассеяние, были расшифрованы структуры парвальбумина [554), гемоглобина [555, 556), ферроксина и селенобиотинилстрептавндина [556], а также селенолантионнна [557).

Приобретенный опыт работы с МАД позволил Хендриксону и соавт. усовершенствовать многие экспериментальные и математические процедуры резонансного метода [558), Были разработаны специальные подходы к оптимизации величины сигнала, уменьшению систематических ошибок, нахождению факторов аномального рассеяния и оценке способом наименьших квадратов получаемых данных. 159 В результате фазы стали рассчитываться с помощью МАД столь же точно, как и при мультиплетном изоморфном замещении.

Решение на основе эффекта аномального рассеяния проблемы фаз приобрело универсальную методологическую форму, приложимую к любым кристаллическим белковым образцам, содержащим аномально рассеивающие центры. Общий характер имеет также предложенный Хендриксоном и сотр. способ введения в белки необходимых при использовании МАД дифракционных решеток [559).

Точность результатов рентгеносгруктурного анализа с МАД,как и МИЗ, очевидно, будет тем выше, чем совершеннее изоморфизм у производных белка с резонансными центрами в первом случае и тяжелыми атомами во втором. Ситуации в этом отношении более предпочтительна при аномальном рассеянии, поскольку здесь все необходимые для установления трехмерной структуры белковой молекулы данные можно получить при облучении несколькими длинами волн одного кристалла. Для реализации такого преимущества был необходим метод, который гарантировал бы сведение к минимуму вероятности нарушения изоморфизма при использовании [п гйш резонансных меток, был бы достаточно прост и мог бы применяться в рентгеноструктурном анализе любых белков. Весьма близок к удовлетворению этих требований метод приготовления селенометиониновых белковых препаратов, дающих аномальное рассеяние, который разработали Хендриксон и соавт.

Характеристики

Список файлов книги