Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 38
Текст из файла (страница 38)
При быстром повышении рН до 8,5 возникал процесс, который контролировался методом трехмерной Лауэ-кристаллографии. Дифракция рентгеновских лучей фиксировалась при трех сериях облучений различных участков кристаллического образца с пятисекундной экспозицией одной съемки в каждой серии. Первая серия экспозиций проведена до впрыскивания в проточную ячейку буферного раствора при рН 8,5, а вторая н третья серии соответственно через 3 и 90 мин после [Ьь 1з, 1).
Пространственные структуры трех фермент-субстратных комплексов расшифрованы с разрешением 1,8 А и В-факторами расходнмости около 20%. Средние различия между координатами атомов этих структур приведены в табл. 1.11. Сопоставление структур до и после повышения рН показало, что одна нз находящихся в активном центре фермента молекул воды предрасположена к атаке ацильной группы на стадии инициации гидролиза ацилфермента и по ходу реакции обнаруживает тенденцию к сближению с карбонильным углеродом. Таким образом, декларация об участии воды в процессе деацилировання трипсинового промежуточного продукта превращается из вероятного предположения М. Бендера, В.
Дженкса и Д. Блоу в экспериментальный факт. Структура промежуточного соединения первой стадии реакции цитохром-с-пероксидазы с перекисью водорода. Согласно существующему представлению, цитохром-с-пероксидаза [ССР) катализирует вос- Таблица!!! Среднеквадратичные отклояенва а иоложеияях (А) атомов отдельных труни е трех разрешенных ао времени дауа-структурах тряисина Все атомы Атомы Атомы Внутрен- Структура белка скткаиой боковых иие неви целей остатки Внеынис остатки Груииа СВ 0,37 0.19 051 0,23 0,44 0,13 0,22 0,17 0,27 0,20 0,24 0,24 0,32 0,14 0,46 0,17 0,39 0,21 !эссэ эа алэ !э-алэ становление перекисей по механизму, состошцему из следующих трех стадий [536 — 5391: 1. ССР (Ре'1') + Н202 -с соединение 1 (РегРО2, Тур-191*) + Н20.
2. Соединение 1 (Ре1902, Тур-191*) + Су1-с-(Ре") + Н+ -+ -э соединение П (Ре'"02 ) + Суу-с-(рев). 3. Соединение П (Ре!с02 ) + Суу-с-(Рев) + Н' -+ -+ ССР (Рен') + Суу-с-(Рещ) + Н20. !52 На первой стадии реакции цитохром-с-пероксидазы с перекисью водорода образуется дважды окнсленный промежуточный продукт, получивший название "соединение Г'. Цель рассматриваемой ниже работы В. Фюлепа и соавт. !498) заключалась в установлении атомных трехмерных структур нативного фермента и соединения 1 и выяснении конформационных изменений ССР, происходящих при образовании промежуточного продукта, на первой стадии катализа.
Соединение 1 получено в кристаллической форме из дрожжевой ССР при реагировании кристаллического фермента, помещенного в маточном растворе в проточную ячейку, с находящейся в маточном растворе Н2О2. Реакция между ферментом и Н2О2, протекание которой регистрировалось с помощью спектров поглощения в видимой области (550 — 750 нм), почти полностью завершалась при б' через несколько минут. После этого концентрация образовавшегося соединения 1 оставалась практически неизменной (90 — 95%) по крайней мере втечение получаса.
Трехмерные структуры нативного фермента и его первого промежуточного производного расшифровывались методом Лауз-кристаллографии с разрешением 2,2 А и )т-факторами расходимости — 15,8% (табл. 1.10 и 1.11). Кристаллические образцы имели размеры 0,4 0,4 . . 1,0 ммэ. Использовалась полихроматнческая синхротронная радиация; время одной экспозиции составляло около 0,3 с. Всего было сделано четыре серии независимых экспериментов на четырех кристаллах при четырех различных ориентациях образцов (4 для натнвного фермента и 4 для соединения 1). При сопоставлении геометрии найденных структур авторы обнаружили изменения, вызванные переходом ССР в соединение!. Они коснулнсь только области активного центра, причем главным образом его дистальной части (рис. 1.41), В нативном состоянии фермента лигандсвязывающнй карман над атомом железа заполнен тремя молекулами воды. При образовании фермент-субстратного комплекса две из них вытесняются, а третья немного смещается, но по- прежнему остается связанной с остатком Т~р-51 и Ре-содержащей группой гема.
После возникновения соединения 1 и гетеролктического расщепления пероксидной связи атом субсгратного кислорода связывается с железом, изменяя его окисное состояние от высокоспинового ферридо низкоспинового ферро-состояния (Реп' -~ Рею). Атом железа, образовав связь Ре — О на расстоянии - 1,7 А, перемещается на 0,3 А от плоского гема в направлении дистального Н1з-52. Расположенная несколько в стороне боковая цепь Агй-47 смещается на 1,3 А к ферро-кислородному атому и образует с ним водородную связь. Расстояния между ферро-кислородом и атомом Х' остатка Агй-48 составляют 2,8 А, атомом Х" остатка Т~р-51 — 2,7 А и атомом Х' Ниь52 3,6 А, что слишком велико для водородной связи. При образовании соединения 1индольное кольцо проксимального остатка Тгр-191, отдавая электрон ферро-кислороду,окнсляется.
Возникший катион-радикал с зарядом на атоме индольного азота взаимодействует посредством водородной связи Х' — Н...Оа' с кислородом заряженной кэрбокснльной группы боковой цепи Азр-235; второй кислород этого остатка (Озз) связан с группой Х вЂ” Н Н1з-175. Поскольку заметное изменение геометрии активного центра в этой области отсутствует, высказанные соображения о распределении электронной плотности в проксимальных остатках представляют собой лишь одну из версий.
Фотолиз комплекса многлобина е окисью углерода (МЬ ОС). Недавно были опубликованы два структурных исследования этого комплекса, которые в экспериментальном отношении можно считать вершинами современной белковой кристаллографии [540, 541). Обе работы посвящены изучению механизма фотодиссоциации ингибированного окисью углерода миоглобнна; МЬ ОС+ лг ~~ МЬ* ОС <~ МЬ+ СО. Цели обеих работ состояли в определении положения молекулы СО в переходном состоянии и выяснении реакции активного центра белка на разрыв связи Ре — О. Экспериментальное решение и той и другой задачи требовало невозможного от традиционного метода рентгеноструктурного анализа, а именно установления трехмерной структуры короткоживущего промежуточного комплекса МЬ* ОС и сопоставления со структурами нативного миоглобнна и его ингибиторного комплекса.
Однако в настоящее время подобные задачи (а их великое множество) поддаются решению с привлечением синхротронного излучения, требующего незначительных экспозиций (в рассматриваемых двух случаях нескольких минут). И. Шлихтинг н соавт. в качестве объекта исследования выбрали мутантный миоглобин, образующий гсксагональную крисгалличсскую Ф х Ф Б с л в 5 -.
Х х о х Ф х Ф '3 х д Фх с л х х о. $ ФФ 4 О о Ф о Ф о х с Ф й х х Ф Ф о с х о Ф с с С х х 2 х Ф о о О 03 О о 2 б Й о о О й О Р а о и Й. 3 и 8 3 о о О, Р и с.! 42. Схема экспериментальной усганонки длл получения реютенонской дифракдии кристаллами миоглобин с окисью углерода а продессе фотолиза 1540 — 542) решетку [540). Образец охлаждался жидким гелием до — 20 К и облучалая для получения дифракционной картины сннхротронной радиацией, а для инициации и поддержания фотолиза видимым светом от обычного источника [рис.
142). По аналогичной схеме строился эксперимент в работе Т. Тенга и соавт. [541[. Различия заключались в использовании нативного миоглобина (из спермы кита), кристаллы которого имеют не гексагональную решетку, а моноклинную; образец охлаждался до температуры — 40 К и облучался мощным лазерным источником света. Результаты обоих исследований, за исключением некоторых количественных расхождений в оценке конформациониых изменений активного центра миоглобина, совпали. Было найдено, что при фотодиссоциации комплекса молекула СО удаляется от атома Ре, но остается в активном центре и располагается параллельно плоскости группы гема на расстоянии — З,б А.
Атом Ре одновременно смещается в ту же сторону на расстояние 0,2 А [540[, Помимо этого Шлихтинг и соавторы отметили изменения при фотолизе положений боковых цепей дистальных Н!а, Агя и проксимального Ниь а также а-спирали Р. Т. Тенг и соавторы таких наблюдений не сделали, что, по-виднмому, нельзя объяснить разной упаковкой кристаллов нативного и мутантного миоглобина.
Г. Филлипс ранее показал, что мутация образца, использованного в работе[540[, не вызывает конформационных изменений в трехмерной структуре белка и не влияет на его физиологические свойства[543). Отмеченные структурные изменения при фотолизе согласуются со спектральными данными и результатами расчета молекулярной динамики [544 — 547[, В этом разделе были рассмотрены результаты опубликованных к концу 1994 г, рензтеноструктурных исследований механизма функцяо пирования белков, выполненных с привлечением синхротронного излу. чения. Таких работ пока немного, но именно они отражают принци пиальную тенденцию развития метода. Если несколько лет назад его задача могла формулироваться только как изучение трехмерных структур белковых молекул и их стабильных комплексов, то теперь доступными для исследования на том же атомном уровне становятся трехмерные структуры промежуточных соединений.
Таким образом, рентгеноструктурный анализ перешел, ничего при этом не теряя в разрешающей способности и достоверности получаемых результатов, от изучения молекулярной морфологии начальных и конечных продуктов физиологических реакций к молекулярной морфологии промежуточных соединений.
Это событие знаменует собой скачок в развитии метода, качественное изменение его возможностей в решении огромного числа новых задач молекулярной биологии. 4.2. МУЛЬТИДЛИННОВОЛНОВАЯ АНОМАЛЬНАЯ ДИФРАКЦИЯ Самой сложной проблемой рентгеновской кристаллографии белка является фазовая проблема. Именно она около двух десятилетий, когда уже имелась полная ясность в отношении всех других принципиальных вопросов рентгеноструктурного анализа, сдерживала расшифровку дифрагированных белковыми кристаллами пучков лучей, построение карт электронной плотности и установление трехмерных молекулярных структур. Реконструирование пространственного строения белка по наблюдаемым в дифракционной картине многим тысячам рефлексов возможно лишь при знании амплитуды и фазы каждого из них.
И если значение амплитуды можно оценить путем прямого измерения интенсивности вторичного рентгеновского излучения, то фаза есть расчетный параметр, нахождение которого непременно связано с привлечением дополнительного экспериментального материала. Решение фазовой проблемы было найдено введением в рентгеноструктурный анализ белка его изоморфных производных невалентных комплексов белка с тяжелыми атомами (Ап, РЬ, Н8, А8, Т1 и др.), присоединение которых не должно искажать пространственного строения белковой молекулы и кристаллической решетки.
Тяжелые атомы обладают большой электронной плотностью и, следовательно, значительной интенсивностью томсоновского упругого рассеяния, что сказывается на структурных факторах многих рефлексов и заметно изменяет картину рентгеновской дифракцни. Различие интенсивностей дифрагированных пучков кристаллами нативного белка и его производных можно использовать для определения фаз, если предварительно установить положения тяжелых атомов. Существует несколько различных способов решения этой задачи [198, 5481.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
