Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 37
Текст из файла (страница 37)
ллрнал масса, кДл Рлзрс~лслис*, г[ Белок Данные о структуре Исгсчнлк Дрнмсчллмс 1,9 16,6 [504) 2,0 18Д 83 Комплексы фермента с мграмс-аконшатом и нитроцит!лпом 2,05 17,0 [5!35) Та б л и ц а1.!0[продолжение) Разрсшсллс, я Данные с структуре Молекулярная масса, хДа Литература Примечание Белок [507) 16,2 2,1 [508! 10,5 0,83 14,8 [510) 16,9 1,30 9 Галоалкандегало- ХлпйвЬааег 36 Моиомер геназа ащопорМсщ Человек 22 Мономер 1! Аконвтаза Бык, свинья 12 Пируваткиназа ЕасЮЬас!Инз 270 Гомстетрамер р!апмппп 13 Крамбии Смщйе 5,5 Мономер аЬузмгйса 14 Токсин П Аллик!оввз 7 аммгайз !5 Онкомодулин Оцухолевые 12 Э Размеры кристалла: 0,40 0,40.0,15 ммэ; моно- лроматизированное графи- том СнК„-излучение трубки ЕИюп.
Трубка ЕИюп Ох21 с вращающимся анодом; время экспозиции 48 ч Размеры кристалла: 0,25 0,25 О,! 5 ммз; источник СнК„-излучения — трубка К[)200 с вращающимся мюдом Размеры кристалла; 0,70 0,700,20 ммз; монохроматизированное никелем СнК,-излучение трубки Сх21 с вращающимся анодом; время экспозиции ! 2 — 1 8 дней; фокусное пятно 0,2 мм Размеры кристалла: 0,70 0,70 0,70 ммз; использовалось СвКо-излучение трубки КП22ОВ с вращающимся анодом и синхротронное излучение; температура 4'С Монохроматизированное графитом СвКп-излучение трубки Ьйсо!ег 1.Т-1; каждая из 32322 рефлексий сканировалась с постоянной скоростью 58,6' в! мин.
температура 130 К За!!алиная трубка с СнКг,- радиацией и Ы)-фильтром, трубка ЕПюп Ох21 с вращающимся анодом Размеры кристалла: 0,20 0,60 0,80 лгмз; монохроматизированиое СвК -излучение трубки ЕИюп Ох16 с вращающимся анодом Та б л и ц а!.10(продолжение) Разрешение, А Мояску- дярнаа масса, кДа Данные о струкзуре Исгочннк Белок Примечание Литература № е(д [51Ц 1б Апгитело РаЬ!7/9 !802 Комплекс РаЬ 17]9 с пептидом ГО!-107 гемагтлютиннна вируса гриппа 2,80 19,0 25,0 [512] Та б л и ц а!.10(окончание) Литератур» Примечание Белок № в(в [513] 19,0 [5 14] Сиихротронное излучение; аномальнаа дифракция на четырех длинах волн Яе (МАД); температура 277, 293 и 1 10 К. [515] Сннхротронное излучение: аномальная днфракция на трех длинах волн на атомах Ре в четырех [4ре-48] кластерах тетрамера (МАД) 22,4 210 Гомотетрамер 3,0 Вас(Пнз щЫПВ Глутамин-5-фгю- 4юри Возил-1-пщю- фосфат амндо- траисфераза 20 «огорого собраны днфракянснньм данные (ндя г !Р «ся Р ас П =,' " 100.
17 Домен НН5 лин- Эритроциты 8,5 Мономер керного гисгона птиц (фрагмент 24 — 9б) Медяку Да""'м с Разрешение, Р:фактор Ишочшх хярная стрдктгре д яь масса, кДа 18 Эндонуклеаза Ввсгбнз 25 Гомодимер 1,95 ВатН! (натнвная и шпу1о!ьдпе!ас Яе-Меб я:пз 19 Гонадотропин (на- Человечески 28 Гетеродимер 2,6 19,9 тивиьгй и Яе-Меб й эмбрион В крнстааяографня белка разрешение опрсдедяетса минимальным мс:кпдсскасгным расстоянием (д 1, я пределах пределах которого значения фактора рассеянна Р включены в расчет рядов Фурье). * Фактор расхсднмастн Д «онтрояирует эффективность уточнсняя я аяредеяястся во формуле: Миннмааьные размеры кристалла: 0,30 0,04.0,02 ммэ; СнК -излучение трубки ЕПюп бх18 с вращающимся анодом; фокусное пятно 0,1 мм; температура — 150"С; время экспозиции свыше 10 дней Синхротроииое излучение трех длян воли 0,9802, 0,9795 и 0,9150 А, соответствуюв(их полосе поглощенна Яе.
фазирование по методу мультндлинноволиовой аномальной дисперсиИ. Рекомбинантная последовательность [Яе-Ме!]-СН5 продуцировалась плазмндами Е. соЬ СнК,-излучение трубки К ()200 с вращающимся анодом и синхротронное излучение; углы рассеяния соответствовали длинам волн лри крае поглощения Яе (0,979 А), пике поглощения (0,978 А) и в удаленной от поглощения точке (0,900 Аг); температура 5'С. Использован метод МАД на несколькнхдлинах волн перспективу для изучения механизмов протекающих в белковых кристаллах процессов путем исследования трехмерных структур промежуточных соединений, время жизни которых продолжительно, или оно может быть пролонгировано при изменении внешних условий.
Открывающиеся здесь возможности делают метод рентгеноструктурного анализа еще более уникальным. Можно с уверенностью предположить, что использование синхротронного излучения позволит непосредственно наблюдать за кинетикой конформационных и химических изменений структур белков на атомном уровне по ходу, например, ферментативных реакций. О том, что такая возможность появится в самом недалеком будущем, свидетельствуют результаты попыток последних двух лет подойти к рассмотрению динамических проблем молекулярной биологии с помощью рентгеноструктурного анализа. Есть даже работа, обсуждаемая ниже, в которой такого рода задачу пытаются решить, используя традиционный источник излучения рентгеновскую трубку.
Мехаянзм функционировяяия галоаляяндегалогеназы. Авторы ряда работ применили рентгеновскую кристаллографию к изучению механизма каталитического акта галоалкандегалогеназы (табл. 1.10) [503— 5051. Трехмерные структуры фермента, монокристалл которого постоянно находится в маточном растворе, были расшифрованы по картам электронной плотности, рассчитанным по дифракциям образца в отсутствие и в присутствии субстрата 1,2-дихлорэтана 15041.
Прн рН 5 и 4', условии, далеком от оптимального, (рН 8,2 и 22'), субстрат связывался с активным центром, однако развития каталитнческой реакции не происходило. Образовавшийся невалентный фермент-субстратный комплекс Михаэлиса оставался стабильным как угодно долго, и поэтому его структура могла быть определена при использовании излучения рентгеновской трубки, экспозиции в 48 ч и сохранении всех других условий анализа нативного фермента. Найденное расположение субстрата в активном центре в схематической форме представлено на рис.
1.39. Один атом хлора (С1,) в комплексе располагается на расстояниях 3,6 и 3,2 А от атомов азота боковых цепей Тгр-125 и Тгр-175 и взаимодействует с водородами двух связей Х-Н. Другой атом хлора (С1з) сгабилизирован дисперснонными взаимодействиями с бензольными кольцами РЬе-128 и Рпе-172. В найденной конформации сбубстрата в активном центре атом углерода С~ сближен с кислородом О ' боковой цепи Азр-124 (3,8 А), что главным образом и обусловливает продуктивность невалентного комплекса. При нагревании кристаллического образца до комнатной температуры происходит разрыв связи С~ — С!ь сопровождаемый образованием иона С1, и алкилированием кислорода 08' остатка Азр-124, Именно на такое изменение комплекса указывает расшифрованная трехмерная структура, которая возникает и остается стабильной в условиях рН 5 и 22'.
Ее схема приведена на рис.1.40. Наконец, при рН 6,2 и 22' алкилированный фермент гидролизуется молекулой воды, активированной боковыми цепями взаимодействующих друг с другом остатков Нпь289 и Азр-260. Продукты Р па.!28 дар-г Р и с. 1.39. Схема активного центра невалентного комплекса гало алка ндегалоген азы с ! 2-дихлорэтвном [504] 78 Н СЗ, Рле-128 Р и с. 1.40.
Схема активного центра ацилфермента, образованного при взаимодействии галоалкандегалогеиазы с 1,2- дихлорзтаном 15041 149 реакции удаляются, а фермент возвращается в исходное состояние, что н фиксирует рентгеносгруктурный анализ. Таким образом, в работе (504) экспериментально подтвержден двухступенчатый механизм реакции галоалкандегалогеназы, предложенный ранее [522). В каталитической реакции этого фермента, протекающей в условиях 'ш чгко, время жизни промежуточных продуктов слишком коротко для проведения кристаллографического исследования. Авторам удалось путем изменения рН и температуры замедлить процесс, разделить его на две стадии и изучить атомные трехмерные структуры с разрешением 2,0-2,4 А и К-фактором 16, 5-19, 5% соответствующих фермент-субстратных комплексов.
Показано, что центральную роль на первой стадии алкилирования играет в качестве нуклеофила карбоксильная группа остатка Аар-124, а на второй стадии деалкилирования — молекула воды, атакующая центральный атом углерода сложноэфирной группы ковалентного промежуточного соединения. Девцилированне трнпсина. Аналогичное по своей направленности исследование одновременно было проведено П. Зингсром и соавтс с классическим в энзимологии объектом, трипсином (500). Использован кристаллографический метод Лауэ с временным разрешением и полихроматическим синхротронным излучением.
Трудами многих исследователей, прежде всего М. Бендера н В. Дженкса, уже давно была разработана химическая схема каталитического акта сернновых протеиназ, в том числе трипсина (523— 525): Е~-Б ~~ ЕЯ ~~ ЕБ ~+ ЕА ~~ ЕА <~ ЕА ~+ Е+Р Р, 1Ч Ч Ч1 ЧП Механизм триптического гидролиза, согласно предложенной схеме, включает последовательную цепочку химических стадий взаимодействия фермента и субстрата, протекающих через ковалентные промежуточные состояния. Каталитический процесс начинается с образования невалентного комплекса Михаэлиса (П), в котором гидроксил Бег-195 и имидазольнос кольцо Н(а-57 фермента оказываются сближенными соответственно с карбонильной и амидной группами расщепляемой пептидной или сложноэфирной связи субстрата. В результате их согласованных взаимодействий нсвалентное ферментсубстратное связывание переходит в ковалентное с образованием сначала малоусгойчивого промежуточного соединения так называемого тетраэдрического аддукта (1П). Последний распадается на ацилфермент и амин (1Ч), а при гидролизе сложного эфира на ацилфермент и спирт, Далее следует деацилирование, которое проходит в принципе аналогичным образом, но в обратном порядке и с участием в качестве нуклеофильного агента не атома От боковой цепи Бег-195, а молекулы воды.
Вновь образуется метастабильный тетраэдрический аддукт (Ч), 150 распадающийся, проходя стадию невалентного комплекса [Ч1), на исходный фермент и второй продукт реакции [ЧП). Химический механизм действия протеолитических сериновых ферментов был разработан до появления результатов рентгеноструктурного анализа пространственного строения их молекул. Крнсталлографическая структура нативного трипсина с разрешением 1,8 А, позднее уточненная до 1,5 А, была установлена Р. Штраудом и соавт. [526-528[, а также Р.
Хубером, В. Боде и соавт. [529-531[. Геометрия активного центра идентифицирована на основе результатов рентгеноструктурного анализа комплексов трипсина с белковыми ингибиторами животного и растительного происхождения [532-534[ н необратимыми синтетическими ингибиторамн [535[. Показано, что во взаимодействии с субстратом и при образовании промежуточных продуктов катализа непосредственно участвуют гидроксильная группа остатка Зег-195 и нмидазольное кольцо НВ-57, которые расположены на поверхности белковой глобулы и образуют водородную связь Хгз...Н-От. Остаток НЬ-57 сближен также с Азр-102, и между ними реализуется взаимодействие Ф' — Н...О~а. Вернемся теперь к работе Зингера и соавт. [500), в которой с помощью рентгеновской ди<Ьракции синхротронного излучения изучен механизм действия трипсина на второй стадии каталитического акта ' [1Ч-ЧП). Исследование началось с приготовления устойчивого промежуточного соединения ферментативной реакции ацилфермента [Ч!) путем присоединения л-гуанидинбензоата [ОВ) к Зег-195 трнпсина, находящегося в кристаллическом состоянии в маточном растворе при рН 5,5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
