Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 36
Текст из файла (страница 36)
В 1959 г. Л. Парратт предложил использовать в кристаллографии в качестве источника рентгеновского излучения сннхротрон [488). Заряженные частицы, двигаясь по кругу в синхротроне с релятивистскими скоростями в однородном магнитном поле, начинают испускать прн торможении и искривлении траектории сплошной спектр электромагнитных волн в форме острого конусного пучка с углом $38 47лт Р и с. !ЗК Зависимость ин- тенсивности излучения )ч(Л) синхротронв в г. Деярсбэри от длины волны Н(Л) — число фотонов! 1с. ирах А) а волосе шнрииов 0,1% хвя в=2.0!'эв, В 1,2 тесла, 1=1,0 А и К=5.5 и уь77Ь а/7 72 АРН уа сэе 817 уй Яа .4У ДО 5й Длина далнвг,А расхождения -0,018' и осью, совпадающей с мгновенным (тангенциальным) направлением движения.
Коротковолновая часть спектра синхротронного (магнитотормозного) излучения (рис. 1.38) имеет пгирокий максимум в области, представляющей интерес для рентгеноструктурного анализа. Полихроматическая радиация синхротрона, в отличие от традиционных источников, может быль монохроматизирована на значительно большем участке длин волн и, следовательно, дать мощный поток рентгеновских лучей. У электронного синхротрона в г. Дейрсбэри (Великобритания) полезный поток фотонов )х)(Л) по меньшей мере в 102 — 105 раз более интенсивен, чем у самых совершенных современных рентгеновских трубок с вращающимся медным анодом. Идея Парратта стала предметом серьезных дискуссий, однако, долгое время оставалась нереализованной.
Сомнения вызывали как возможность фактического увеличения интенсивности дифракционных пучков, так и способность белковых кристаллов выдерживать интенсивное облучение [489). Лишь в 1971 г. синхротронная радиация была применена в дифракционных исследованиях биологических объектов, Г. Розенбаум и соавт. [490, 49Ц, изучая рассеяние рентгеновских лучей под малыми углами мышечных волокон, показали, что использованное ими излучение после монохроматизации и фокусировки на два порядка превосходит максимальную интенсивность коллимированного фильтрованного СпК -излучения рентгеновской трубки и при этом не разрушает облучаемый объект.
Использование синхротронной радиации в методе малоуглового рентгеновского рассеяния было предложено М.А. Мокульским и соавт. [492). Вопрос о возможности применения синхротронного излучения в рентгеноструктурном анализе белковых монокристаллов впервые был рассмотрен в теоретическом плане Г. Уискоффом [493) и С. Харрисоном [494), а в экспериментальном Лж.
Филлипсом и соавт. [495). В последней работе получены четкие фотографии днфракционных рефлексов от радиации электронно-позитронного синхротрона, рассеивающейся плоскостями монокрисгаллов белковых молекул рубредоксина, азурина, фактора роста нервных клеток и Ь-глутамин-аспарагиназы. Некоторые условия эксперимента приведены в табл. 1.9.
Авто- Табл ила[9 Дифрмозионные данные, иалучеиные с синаротронным излучением [495] 0,50 0,40.0,30 0,400,35 0,12 0300,ЮО,]0 0,50 0,05 0,[35 1,74 1,7 Рубредоксин Азурин Фактор роста ВО[о-Азр-аза 1,38 1,74 1,38 3-[7 2,7 б,О 3,5 ры показали, что при замене излучения запаянной рентгеновской трубки на синхротронную радиацию (при сохранении прочих условий эксперимента) интенсивности пучков дифракционного рассеяния теми же кристаллами белков возрастают более чем в бб раз и, оведо вательно, во столько же раз уменьшается время экспозиции, Не сбылись опасения быстрого распада кристаллов в синхротронном потоке.
Напротив, нз-за уменьшения экспозиции скорость разрузпення исследованных объектов оказалась существенно ниже, чем при использовании ]з[[-отфильтрованной СвК,-радиации. Вместе с упомя нутыми достоинствами авторы также отмечают низкое угловое расхождение потока и легкую настраиваемость синхротрона на выбранную длину волны, что облегчает селективную оптимизацию аномальных вкладов фактора рассеяния. В заключении сделан вьзвод о перспективности нового источника излучения в структурном изучении белков.
Действительно, значительное увеличение интенсивности рассеяния, сокращение времени экспозиции, несколько менее жесткие требования к размерам облучаемых кристаллических образцов и ряд других полезных качеств этого источника открыли перед рентгеноструктурным анализом белков неведомые ранее возможности в исследсзвании микрокрнсталлнческнх белковых объектов, проведении динамических и иных экспериментов, о некоторых из которых рассказывается ниже. В настоящее время более трети работ в области рентгеновской кристаллографии белка выполняется с использованием синхротронного излучения.
В табл. 1.10 приведены некоторые данные рентгеноструктурного анализа белков, дифракционные картины которых были полученЬ1 при использовании синхротронной радиации (1-8, 17 — 20) и К -излучения рентгеновских трубок с вращающимися медными анодами (9-1б), Табл, 1.10 отражает лишь небольшую часть публикаций конца 1993- первой половины 1994 гг., посвященных расшифровке трехмерных структур белковых молекул и их комплексов, Если судить о достоинствах двух методов рентгеносгруктурного анализа по величинам разрешения н фактора расходимости (В), то следует заключить, что природа источника излучения практически не отражается на конечном результате. При использовании как синхротронной радиации так и излучения рентгеновской трубки удалось расшифровать простран- 140 ственное строение белковых молекул с рекордным разрешением, преодолев в обоих случаях одноангстремный барьер [бактериальный трипсин (2) и крамбин (13)) и достигнув при этом расходимости около 10% величины, близкой фактору й в уточнениях структур небольших органических молекул.
Заметно не отличаются методы и в отношении размеров облучаемого кристалла и диаметра фокусного пятна. Так, при определении трехмерной структуры антитела ЕаЬ 17/9 (16) с использованием излучения рентгеновской трубки Ейоп Ох18 с вращающимся анодом образец имел размеры 0,30 0,04.0,02 мм', а фокусное пятно составляло всего 0,1 мм. Этн параметры явно не уступают условиям эксперимента с синхротронной радиацией. Можно однако полагать, что ситуация с кристаллизацией белков в последнем случае потенциально несколько предпочтительнее, так как мощное синхротронное излучение и его острый фокус позволяют использовать кристаллы, имеющие меньшие размеры н содержащие большие элементарные ячейки.
Примеров, иллюстрирующих такую возможность, пока нет. На сегодняшний день проблема кристаллизации белков в обоих случаях стоит столь же остро, как и десятки лет назад. О трудностях получения качественных монокрнсталлов требуемой величины говорится почти во всех работах. Типично в этом отношении замечание авторов, исследовавших трехмерную структуру фермента нз 839 аминокислотных остатков, лнпоксигеназу 1; "Кристаллы белка удалось получить после опробования более тысячи различных условий кристаллизации" [516. С. 1482). Особенно сложное положение, как уже отмечалось, с кристаллизацией мембранных белков (о предпринимаемых здесь усилиях и относительных успехах см.
[517-520)). Сопоставление приведенных в табл.1.10 данных приводит к выводу, что методы рензтеноструктурного анализа, использующие синхротронную радиацию и излучение рентгеновской трубки, не обладают друг перед другом ощутимыми преимуществами при изучении нативных конформаций белковых молекул и их стабильных комплексов, т.е.
во всех тех случаях, когда решается статическая задача определения атомных трехмерных структур. До недавнего времени полагали, что в компетенцию рентгеноструктурного анализа по принципиальным соображениям не может входить рассмотрение вопросов, касающихся динамики межмолекулярных и внутрнмолекулярных взаимодействий белков. Использование синхротронного излучения заставило если и не изменить такое представление на противоположное, то во всяком случае поставить под сомнение его безапелляционность. Как видно из табл. 1.10, новый источник излучения снижает время экспозиции с многих десятков часов (9), дней (16) и даже недель (11) до долей секунд (3,5).
Дж. Томас в статье, посвященной 80-летнему юбилею методов Брэгга и Лауэ, отмечает, что дифракционные рефлексы белковых кристаллов, облучаемых синхротронной радиацией, могут быть измерены за 100 пс, т.е. 10сш с [52Ц. Значительное сокращение экспозиции не только позволяет существенно сократить время анализа трехмерной структуры белка, но и открывает принципиально новую 141 Та б л н ца!10 Молеку- лярная ! масса, кДа Р.-фактор % Разрсвмнвс, А Данные о структура Ы и/и Ьсэах Источник Прамсчаввс Люсратур Гемагглютгинин [нйнепта т1шз 60 1омочрнмерные комллексь! гликолротеина с рецепторнымн аналогами Разлюры кристалла; [496] 0,70.0,70.0,70 ммз; синх- ротронное излучение Л=0,905 А;время экспонирования 1,39 (9=0-44,4 ) и 3,33 (Чю45-90') мин/град, температура 108 К 2,15 21,6 10,7 Синхротронное излучение; [497] температура 120 К (Часагд(орз[з Бактериальный трипсин 20 Мономер 0,96 Цито хром-спероксидаза (ССР) 34 Ре-гемоцержащнй фермент Размеры крнстаяла; 0,40 0,40.1,0 ммз; поли- хроматическое синхротрониое излучение (днфракция Лауэ); время одной экспозиции 300- 400 мс; температура 6'С Синхротроннаеизлучснис 2,2 15,8 [498] 4 Транскетолаза 5.
сегет!а!ае 148 Гомодимер 2,0 15,7 [499] Та б л и ц а 1.10(продолжение) Разрешение, Д-фактор А % Махску- Данньм а харкая структуре мао:а, кда Литература Примечание Базак [5ОЩ Размеры кристалла: 1,0 0,40.0,40 ммз; полнхро. магическое синхротрониое излучение (дифракция Лауэ); время одной экспо- зиции 800 мс; РН 5,5-8,5 Сюгхратроннае излучение 22,1 2,0 24 Мономер 5 л-Гуанидни-бе наоил- Бык замещенный трипснн [50Ц 19,3 465 Гоматетрамер 160 6 11-Галактозвдаза Е, сад [502] Размеры кристалла: 1,50 0,30 0,20 ммз: СаКа- излучение трубки с вращающимся анодомвсннхротронное излучение СаКц-излучение трубки (разрешение 3,0 уг) и сннхротроиное излучение (разрешение 2,0 А) 12,4 2,9 7 Глюкоздегидроге- Тйенпор)юш наза а ьс! бофп1шп [503] 18,0 2,0 40 Фермситингнбгпориый комплекс Мышь Данные реизтеноструктурного анализа белков, иолученные с ясиользаваннем синхротронной радиации я юлучення рентгеновских трубок Т а б л и ц а 1.10 [продолжение) Малсху.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
