Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Это нашло подтверждение в исследовании структуры изолированного октамера, на поверхности которого была обнаружена бороздка белковой суперспирали [417, 418]. Она имеет внешний диаметр - 65 А, шаг — 28 А и левую закрутку, что полностью отвечает параметрам суперспирали ДНК в нуклеосоме. Таким образом, поверхности гистонового кора и закручиваемой вокруг него двойной спирали ДНК соотносятся между собой так же, как поверхности винта и гайки. Между тем, образование нуклеосомы вряд ли представляет собой ввинчивание белкового октамера в строго детерминированную нуклеотидную структуру, Этому препятствуют, во-первых, наличие на спиральной бороздке нуклеосомного сердечника чередующихся возвышений и впадин и, во-вторых, то обстоятельство, что суперспираль молекулы ДНК в свободном состоянии не является стабильной формой, хотя, по-видимому, и относится к низкоэнергетическим конформациям.
Более вероятно, что образование нуклеосомы происходит путем накручивания лабильной двойной спирали ДНК на гистоновый кор, подобно наматыванию нитки на катушку. Таков же механизм и противоположного процесса освобождения двухцепочечной ДНК от белкового комплекса. В пользу этой модели свидетельствует комплементарность возвышений н впадин внутренней центральной части нуклеосомы профилю контактной поверхности суперспирали ДНК, образованной В-формой ее двойной спирали. В связи с установлением трехмерной структуры гистонового октамера (Н2А-Н2В-НЗ-Н4)з и его стерических взаимоотношений с ДНК встает ряд вопросов принципиального порядка. Например, каковы механизмы и причины спонтанного возникновения белкового комплекса и самосборки нуклеосомы в целом'? Не менее интересен и вопрос о том, каким образом происходит освобождение нуклеотидной цепи от гистонового кора? Дело в том, что доступность ДНК, входящей в состав нуклеосом, существенно ограничена на тех участках, где двойная спираль соприкасается с поверхностью октамера.
Присоединение специфических регуляторных белков к функционально активным нуклеотидным последовательностям становится возможным только при освобождении соответствующих участков связывания ДНК от нуклеосом. Поэтому выяснение причины распада нуклеопротеиновых комплексов столь же важно, как и исследование причины их возникновения.
Можно полагать, что после того, как механизм создания и разрушения нуклеосом получит свою количественную трактовку, будет решен и один из наиболее интригующих вопросов, касающихся гисгоновых белков, а именно, почему гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4 в отношении своих аминокислотных последовательностей являются самыми консервативными в природе белками (табл. 1.7)? Не исключено, что нуклеосома представляет собой уникальную по своей структурной организации клеточную субъединицу. Из общих соображений очевидно, что в ней должны сочетаться идеальная согласованность внутри- и межмолекулярных взаимодействий белков, образующих гистоновый октамер, комплементарность поверхности нуклеосомного кора контактной поверхности суперспирали ДНК и в то же время наличие тонкого баланса сил противоположной направленности, нарушение которого при соответствующих изменениях внешних условий ведет к быстрому смещению равновесия в сторону возникновения или распада нуклеопротеинового комплекса. Консервативность гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 указывает на то, что нормальное функционирование такой системы практически исключает амннокислотные замены.
Вопросы, касающиеся природы и механизма взаимодействия гистонов друг с другом и двойной спиралью ДНК, возникли задолго до привлечения к их рассмотрению рентгеноструктурного анализа. И хотя установление трехмерной структуры нуклеосомы окончательно не решило ни одного из них, ситуация в этой области претерпела качественное изменение. Стала известна морфология изучаемого объекта, и все вопросы о его функционировании перешли из натурфилософской категории в категорию строго научных.
Что это означает, детально рассматривается в двух последующих томах настоящего издания, П2 Р и е. !.27. Вращение дао»- иоя спирали дНК ири еа реилииации апь а щатьсе Метр дли с еедущ цепи ДНК Структура Х-концевого фрагмента ДНК-топонзомеразы 1. При реплнкации ДНК скорость полимеризации у бактерий и млекопитающих колеблется соответственно от 500 до 50 нуклеотидов в секунду. При этом на каждые 10 пар оснований новосиптезированной цепи родительская двойная спираль ДНК, чтобье не быль запутанной, должна совершать один полный оборот вокруг своей оси (рнс.
1.27). Следовательно, для беспрепятственного передвижения репликационной вилки с наблюдаемой на опыте скоростью вся хромосома, находящаяся впереди вилки, должна совершать 50 — 55 об/с. Аналогичная "проблема кручения" возникает, очевидно, при транскрипции и рекомбинации ДНК. Во всех случаях она решается с помощью особых ферментов, ДНК-топоизомераз, образующих в спиралях своего рода "шарниры".
ДНК-топоизомераза типа 1 расщепляет фосфодиэфирную связь в одной из цепей ДНК и ковалентно присоединяется,как правило, посредством боковой цепи тирозина к образовавшемуся свободному 5'-концу. Обрыв цепи дает возможность двум половинам двойной спирали свободно вращаться вокруг фосфодиэфирной связи, находящейся напротив разрыва, и тем самым снимать накопившееся напряжение.
Ковалентная связь белок — ДНК высокоэнергетична, а поэтому реакция ферментативного гидролиза фосфоднэфирной связи обратима и не требует участия АТР. После снятия напряжения разорванные концы цепи ДНК соединяются вновь. Таким образом, по своей функции ДНК-топоизомераза представляет собой нечто вроде "обратимой нуклеазы" или "обратимой ДНК-полимеразы". Впервые ДНК-топоизомераза была выделена из клеток Е. со!1 Дж. Уангом в 1971 г.
[4191. До сих пор она остается наиболее широко изученным ферментом подсемейства ДНК- 113 топоизомераз типа 1, к которому принадлежат открытые много лет спустя топоизомеразы 1П Е. со1! [420] и 8. сегеч!яае [421, 422], а также обратимая гираза архебактерии Би!!о1оЬвз ас[доса1бапиз [423, 424]. Помимо описан-ной реакции ферменты этого типа катализируют релаксацию неправильно закрученной линейной суперспирали ДНК, распутывание и замыкание колец единичной цепи ДНК, спаривание комплементарных колец и ряда других родственных операций. Общим для ДНК-топонзомераз типа 1 является механизм каталитического акта, протекающего без использования энергии АТР и непременно включающего стадию временного разрыва только одной цепи двойной спирали ДНК.
Аналогичные по функции ферменты, расщепляющие, однако, не одну, а две фосфодиэфнрные связи и ковалентно связывающнеся с обеими цепями двойной спирали, составляют подсемейство ДНК-топоизомераз типа П [425]. В 1994 г. Х, Лима, Дж. Уанг и А. Мондрейгон опубликовали результаты рентгеноструктурного анализа пространственного строения Х-концевого фрагмента ДНК-топоизомеразы! Е.
со!1 [426]. Трехмерная структура фрагмента полипептидной цепи из 553 амннокислотных остатков и молекулярной массы 67 кДа (целый белок 97 кДа) была определена с разрешением 2,2 А при расшифровке дифракционных картин, полученных при температуре кристаллов — 168' и использовании синхротронного излучения. Данная работа — это первое кристаллографическое исследование топоизомеразного объекта. ДНК-топоизомераза 1 металлофермент, С-концевой фрагмент которого содержит три атома х.п(П) и три участка с двумя дисульфидными связями [427].
Каталитическая реакция расщепления нуклеотидной цепи ДНК включает трансэтерифнкацию между фосфодиэфирной связью субстрата и боковой цепью Туг-319 фермента [428]. В этой реакции не участвует С-концевой фрагмент белка с дисульфидными связями. Что касается атомов цинка, то они также не оказывают влияния на стадию расщепления фосфодиэфирной связи, однако необходимы для замыкания разорванной цепи после релаксации ДНК [429]. Поэтому исследованный в работе [426] фрагмент с молекулярной массой 67 кДа ДНК-топоизомеразы типа ! может катализировать расщепление единичной нуклеотндной цепи, но не в состоянии восстановить целостность суперсйирали ДНК.
Его субстратная специфичность и кинетические характеристики такие же, как у нативного белка нли белка, лишенного цинка [429, 430]. Трехмерная структура Х-концевого фрагмента представляет собой неправильный вытянутый тор с внешними размерами 67х43х86 А. Он образован четко отделенными друг от друга и хорошо наблюдаемыми четырьмя доменами 1 — 1У (рнс.1.28).
Вторичные структуры доменов приведены в табл.1.8. В домен РП входит каталитически важный остаток Туг-319. Активный центр ДНК-топоизомеразы 1, образованный доменами 1, 1П, показан на рис. 1.29. Отверстие тора, свободное от боковых цепей остатков, имеет диаметр около 28 А, так что вхождение в него двойной спирали ДНК в В-форме не должно сопровождаться стернческнмн затруднениями. П4 Таблица!8 Вторичные етрувтуры Х-вевцеаото фратмевта ДНК-тевовтомераты! (рве. 1.281 цоиаи а-Спираль В-Суруктура доиеи а-Спираль З-Структура 1, 1, К, 1., М В,Р,С,Х,О, 13,14 Р,О,К Л. С, О, Е Н 1-4 5-12 Ш 1"и' Укладка эффективно взаимодействующих между собой доменов 1, П1 и 1Ч привела к образованию большой субсгратсвязывающей щели н еще одного отверстия в непосредственной близости от главного отверстия тора и активного центра с аминокнслотным остатком Туг-319. Второе отверстие имеет небольшой диаметр, однако достаточный для прохождения единичной цепи ДНК (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
