Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Образовавшееся соединение неустойчиво н распадается на две часги,одна нз которых включает амино-, а другая — карбокснльную группу(рис.1.23). Исходное предположение М. Джеймса и А. Силецки, состоящее в том, что нуклеофилом в каталитической реакции аспартатных протеиназ является молекула %зз4, оспаривается К. Сугуной н соавт., имеющими иное видение механизма действия ферментов 1369]. Сконструированная ими стереохимическая модель основана на кристаллографических данных о трехмерных структурах нативного ризопуспепсина 1367] н его комплекса с октапептидным ингибитором с восстановленной пептидной связью, расщепляемой в случае субстрата.
В качестве нуклеофила авторы работы выбрали молекулу воды 9У5щ (ЪУз9 в нумерации пеннцнллопепсина), локализованную между двумя карбоксильными группамн остатков Азр-35 и Азр-218 н образующую с ними три водородные связи (рис. 1.24) [369]. Предполагается, что молекула %зщ не подвергается вытеснению субстратом, поскольку прн его сорбции гндролизуемая пептидная связь, испытывая стерическне затруднения, принимает неплоскую, энергетически невыгодную конфигурацию.
В этом положении субстрата карбоннльный углерод расщепляемой связи оказывается против атакующего атома кислорода УУзаь а кислород карбонильной группы располагается на оптимальном для водородной связи расстоянии от гидроксила боковой цепи Аар-35. В результате образования тетраэдрического аддукта группа ОН молекулы воды переходит к субстрату, а атомы Н сначала к внепзнему кислороду боковой цепи Азр- 218, а затем к азоту, Реорганизация промежуточного соединения ведет к разрыву пептидной связи субстрата, десорбции продуктов реакции и восстановлению активного центра. В схеме каталитической реакции аспартатных протенназ, предложенной Л. Перлом (398], нуклеофилом, как и в только что рассмотренной схеме К.
Сугуны и соавт., является молекула воды %зщ (рис. 1.25). Новое в модельном описании Перла состоит в предположении равенства констант кислотности н, следовательно, электронной эквивалентнос- 101 Р н с. 1.25. Схема механизма катализа аспартатных протенназ, предложенная Л. Пирлом ~398] Аир-25 Аарм25 -из .Н-О--Н Аар-25 Аар-125 Аар-25 Аар-1 25 Р и с. !.26. Схема механизма катализа аспартатных протеиназ, предложенная М. Яскольски и соаит.
1374] ]02 ти карбоксильных групп остатков Азр-35 и Азр-218, имеющих обобщенный протон, и, кроме того, во введении в качестве электрофнльного компонента, дополнительно полярнзующего карбонильный кислород расщепляемой связи, двух групп ХН остатков О1у-78 и Азр-79 (нумерация ризопуспепсина), которые входят в последовательность нависающего над субстратом флепа. Действия нуклеофила и электрофила в согласии с предыдущими моделями механизма функционирования аспартатных протеиназ приводят к образованию неустойчивого промежуточного соединения, распадающегося на НзХ вЂ” и — СООН продукты реакции. И в этом случае, как в рассмотренных выше, автор следует концепции напряжения и принудительной деформации, т.е.
постулирует возможность трансформации энергии фермент-субстратных невалентных взаимодействий в энергию искажения пептидной связи, приближающего ее к переходному состоянию и тем самым облегчающего гидролиз. Модель механизма действия аспартатных протеиназ, предложенная М. Яскольски и соавт.(374), основана на трехмерной структуре ретровируса Н1Ч-1 протеиназы. В качестве нуклеофила и здесь выбирается молекула Жкп (нумерация пенициллопепсина), расположенная на равных расстояниях между боковыми цепями остатков Азр-25 и Азр-125 (рис 1.2б).
Учитывая симметрию фермента, авторы поместили одну из гидроксильных групп НзО вдоль оси второго порядка таким образом, что она может образовывать бифуркационную водородную связь с внутренними карбоксильными атомами кислорода остатков аспарагиновой кислоты. Вторая гидрокснльная группа НзО направлена к внешнему кислороду боковой цепи Азр-25. Кислый протон неионизованной боковой цепи Азр-125 образует водородную связь с атомом кислорода молекулы кристаллизационной воды Жю7 Таким образом, согласно динамической модели Яскольски и соавторов, нативная Н1Ч-1 протенназа в равновесном состоянии обладает симметричной системой из пяти атомов кислорода, в поле которых соответствующим образом мигрируют атомы водорода. Симметрия активного центра нарушается при взаимодействии фермента с субстратом.
В результате нуклеофильной атаки одновременно разрушается карбонильная группа расщепляемой связи, изменяется гибридизация атомов углерода и азота (зр~ †> врз), возникает валентная связь С вЂ” ОН и происходит протонизация азота. Иными словами, фермент-субстратный комплекс проходит в одну стадию неустойчивое промежуточное состояние, которое завершается образованием продуктов реакции и возвращением фермента в исходное положение. Высказанные в литературе суждения о стереохимии аспартатных протеиназ отличаются количеством элементарных стадий каталитического акта, положением молекулы воды, осуществляющей нуклеофильную атаку на карбонильный углерод расщепляемой связи, атомными группами, поляризующими кислород этой же связи и способом протонизации атома азота. Несмотря на существенные различия предложенных моделей, они одины в следующих своих исходных положениях.
103 Во-первых, предполагается, что аспартатные протеиназы функционируют по принципу общего катализа и, следовательно, по ходу реакции не образуют с субстратом ковалентных промежуточных комплексов. Во-вторых, утверждается, что для реализации каталитического действия протеиназ необходимо наличие в системе нуклеофила, основного и кислотного катализаторов (расхождение — в их выборе). В-третьих, во всех гипотезах предполагается, что ферментативная реакция гидролиза пептидной связи проходит стадию неустойчивого промежугочного соединения(тетраэдрического аддукта). Эти положения были сформулированы и подтверждены экспериментально при изучении ферментативных и модельных неферментатнвных реакций еще до того, как был выполнен рептгеноструктурный анализ хотя бы одной молекулы аспартатной протеиназы. Ставшие известными трехмерные структуры ферментов и их комплексов с субстратоподобными ингибиторами дополнительно подтвердили некоторые из ранее сделанных заключений и позволили визуализировать уже сложившиеся представления.
В-четвертых, во всех предложенных стереохимических моделях общей является трактовка побудительных мотивов функционирования аспартатных протеиназ, основывающаяся на концепции деформации и напряжения [399). Таким образом, разработанные схемы ферментативного катализа примечательны в том отношении, что они исходят, по существу, из одного и того же экспериментального материала, включающего данные рентгеноструктурного анализа, полученные в последние годы, и базируются на одних и тех же теоретических представлениях о природе биокатализа, сложившихся до становления кристаллографии белков и давно ставших традиционными.
На несовершенство сделанных обобщений указывает то обстоятельство, что при единстве исходного опытного материала и теоретической основы, а также в рамках одного подхода была предложена не одна стереохимическая модель функционирования аспартатных протеиназ, а четыре различные модели, которых, впрочем, могло бы быть и больше. Они не образуют ряда, свидетельствующего о количественном развитии знаний о механизме действия ферментов, а скорее представляют собой букет различных точек зрения. Рассмотренные гипотезы отвечают одному уровню понимания изучаемого явления и равноценны как в своей аргументации, так и предсказательной силе. Что же привнесла нового в изучение каталитическнх реакций аспартатных протеиназ и других ферментов рентгеновскаякристаллография белков? Прежде всего следует отметить, что данные рентгеноструктурного анализа позволили определить область активного центра фермента и ехо геометрию на уровне координат атомов.
Сделать это с такой же полнотой и степенью надежности другим способом в настоящее время не представляется возможным. Использование данного метода для расшифровки трехмерных структур натнвного фермента и его комплексов с различными ннгнбиторамн позволило выявить конформа- 104 ционные перестройки активного центра, которые могут иметь место на разных стадиях каталитического акта. Эти данные так же уникальны и информативны.
Велика роль рентгеноструктурного анализа в исследовании специфичности фермент-субстратных взаимодейсгвий и локализации областей связывания активного центра с чувствятельными местами субстрата и примыкающими к нему с обеих сторон остатками. Что же касается взаимной ориентации расщепляемой связи относительно каталитически активных остатков фермента, отвечающих продуктивному связыванию истинного субстрата, то вопрос остается нерешенным. Высказанные мнения, как это видно иа примере предложенных четырех различных стереохимических моделей функционирования аспартатных протеиназ, могут подразделяться на более или менее правдоподобные, однако все они, несмотря на знание конформаций фермента в нативном состоянии и в комплексе с ингибитором, имеют лишь гипотетический характер.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
