Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 25
Текст из файла (страница 25)
В табл. 1.3 приведены значения двухгранных углов гр, г[г н ю, определяющих геометрию основной цепи ингибитора ренина (СН-66) [39Ц и трех ингибиторов аспартатной протеиназы Н1Ч-1 (()- 85548е, 1гу-365, МЧТ-!01) [374 — 376]. Из сопоставления следует, что совершенно разные ингибиторы при ассоциации с активными центрами аспартатных протеиназ млекопитающих и ретровируса принимают близкие конформационные состояния.
Во всяком случае, различия в значениях двухгранных углов ингибитора ренина и Н]Ч-1 протеиназы не больше, чем различия углов ингибиторов одного фермента. Этот факт, как и данные табл. 1.2, свидетельствует о близких структурных мотивах субстратсвязывающих центров аспартатных протеиназ, независимо от их источника. Рентгеноструктурный анализ ингибиторного комплекса ренина мыши с декапептидом позволил идентифицировать аминокислотные остатки фермента, формирующие специфические карманы, и сделать некоторые количественные оценки их взаимодействий с боковыми цепями остатков ингибитора [391]. Учитывая близость последнего к ]з]-концевой последовательности ангиотензиногена, полученные здесь данные представляют несомненный интерес для последующего теоретического изучения невалентных взаимодействий ренина с истинным субстратом и решения задачи о природе его исключительной специфичности.
В табл.1.4 представлены 34 остатка ренина, образующие десять Таблица 15 Нвмевеиве лесгунией расгаервтвве иентантией ванин!ни остатнее автвпин е венгра ренина врв нвнгбиреааввв СН.бб !39Ц Скоболцьн рецкц, А Комплекс Си.бб, Аз Разница, А субстратсвязывающих карманов (Я,— 54), межатомные контактные расстояния которых с ингибитором в комплексе не превышают 4,2 з(к. Приведенные в таблице остатки находятся на поверхности глобулы водорастворимого белка и, тем не менее, все они (за естественным исключением каталитически важных Азр-32 и Азр-215), как и 4.
Проблема белка, т. 2 97 1.ее-10 агт-12 О!в-13 йе-30 Ар-Зг уег-35 Ие-73 Н!а-74 Туг-75 01у-76 аго77 Ве-110 Рго-11! Рве-П2 Еец-114 Р!в-117 Ча1-120 оба-128 Ча1-130 Ча1-213 Аар-215 зсг-218 Ясг-219 Рае-220 Еев-276 Т!в-283 НЬ-287 Ме6289 Пе-291 Роз-292 Рвз-294 Тат-295 Че1-ЗОО 37,3 7,1 7,3 4,3 3,2 2,7 З,З 33,1 11,7 4,2 15,2 36,1 13,1 3,6 34,9 7,2 3,6 14,0 14,2 5,1 4,8 10,2 12,4 12,7 9,3 16,0 18,5 10,3 30,0 37,6 25,4 5,6 30,1 0,2 1,0 1,8 0,0 0,0 0,1 19,2 0,0 0,3 4,2 32,2 1,2 0,6 21,5 0,1 0,0 5,5 9,9 0,8 О,О 0,0 04 2,5 7,1 5,7 4,8 14,3 0,5 19,0 29,5 10,0 0,2 7,2 6,9 6,3 3,0 3,2 2,7 3,2 13,9 П,7 11,0 3,9 11,9 3,0 13,4 7,1 3,6 8,5 4,3 4,3 4,3 5,7 9,8 9,9 5,6 3,6 10,2 4,2 9,8 1 1,0 8,1 15,4 5,4 взаимодействующие с ними остатки субстрата, являются гидрофобными. Поэтому стабилизация комплекса осуществляется, главным образом, за счет дисперсионных сил. О высокой комплементарности потенциальных поверхностей активного центра ренина и декапептидного ингибитора (субстрата), а следовательно, их предрасположенности к эффективным невалентным взаимодействиям можно судить по многочисленности межатомных контактов фермента с лигандом.
Количественно это подтверждают данные, представленные в табл. 1.5, и показывающие резкое сокращение при сорбции ингибитора доступной растворителю поверхности аминокислотных остатков, образующих покусы Я,— 34 Около половины остатков, в том числе Азр-32, Азр-215 и некоторые остатки флепа, оказываются полностью экранированными лигандом от контактов с внешней средой. Доступная растворителю общая площадь активного центра — 460 А уменьшается в комплексе до — 220 А.
В табл, 1.б сопоставлены поверхностно-доступные площади боковых цепей остатков Рз — Р4 ингибитора СН-бб в двух комплексах — с ренином и эндотиопепсином. Согласно расчету К. Дилвиса и соавт., в первом случае такая площадь равна - б4 Аз, а во втором — - 130Аз 1391].
Данные табл. 1.б свидетельствуют о значительно большей плотности упаковки одного и того же ингибитора в активном центре ренина по сравнению с эндотиопепсином.Особенно высокая комплементарность в рениновом комплексе имеет место в средней части декапептидного лиганда, т.е. в области расщепляемой пептидной связи. Главные цели изучения биокатализа, по-видимому, можно ограничить следующими тремя. Во-первых, достижением понимания принципов стереохимического механизма ферментативного катализа и возможностью количественного описания, исходя из знания структур взаимодействующих молекул, каталитического акта как спонтанно протекающего, взаимообусловленного на всех своих стадиях непрерывного процесса.
Во-вторых, выяснением в каждом конкретном случае причины специфичности фермент-субстратных и ферментингибиторных взаимодействий. В-третьих, целенаправленным конструированием наборов ингибиторов, обладающих наперед заданными свойствами. Возникающие при достижениях этих целей проблемы и возможные подходы к их разрешению будут подробно обсуждены в четвертом томе монографии "Проблемы белка".
А сейчас попытаемся ответить на вопрос о том,что нового привнес рентгеноструктурный анализ в изучение аспартатных протеиназ и в какой мере знание трехмерных структур ферментов и их ингибиторных комплексов смогло углубить понимание механизма каталитической реакции аспартатных протеиназ. Ответ на этот вопрос имеет общее для энзимологии значение, поскольку, как отмечалось, протеиназы являются наиболее изученными во всех отношениях объектами биокатализа.
Рассмотрим гипотетические модели механизма действия аспартатных протеиназ, в основу разработки которых были положены данные о трехмерных Таблица 16 Сранненне иоаерлиостио-достриимл нлощедей боковых целей остатков Рл — Ре ингибатора СН.66 а комнлекаст с ренином и аидотионеисннем Р5 11и Рл Рто РЗ Р1м 1211и Р1 гсо1Ф) 91 Ело Р2 Туг Рз зуг Р4 Бег 20,6 35,7 15,! 11,3 6,9 8,7 7,7 0,4 0„5 О,О 8,3 0,5 0,5 0,6 0,9 0,3 7,2 — 0,6 12,4 38,0 25,6 6,3 13,9 20,2 99 структурах ферментов и их комплексов с субстратоподобными ингибиторами.
О механизме каталитической реакции аспартатиых протеиназ. Первую стереохимическую модель предложили М. Джеймс и А. Силсцкн (392] в 1985 г., использовав для этого кристаллографическую структуру молекулы пенициллопепсина, расшифрованную с разрешением 1,8 А 135б, 3921. О механизме действия аспартатных протеиназ ранее был высказан ряд соображений, опирающихся на знание трехмерных структур ферментов 1368, 393 — 3971.
Однако все они имели незавершенный характер и не претендовали на последовательное описание всего процесса гидролиза пептидной связи, катализнруемого аспартатными протеиназами. В стерсохимической модели продуктивного ковалентного комплекса Михаэлиса, построенного Джеймсом и Силецки, важная роль принадлежит молекуле кристаллизационной воды %284. В активном центре пенициллопепснна она занимает место, одновременно удобное и для образования с боковой цепью Азр-33 эффективной водородной связи, что повышает ее нуклеофнльность, и для атаки на атом карбонильного углерода гидролизуемой связи, что ведет к ослаблению последней.
В этом же направлении действует протонированная карбокснльная группа остатка Азр-213, поляризующая посредством водородной связи карбоксильную группу субстрата н выступающая таким образом в качестве электрофильного компонента системы (рис. 1.23). Отмеченные три взаимодействия инициируют разрушение делокализованной л-н-электронной системы расщепляемой пептндной связи, н с н / УЛ О С вЂ” Н / // Н О С' н с" н / с-с — н I / н' а ыл -'но О Аар-ЗЗ А р-г1З Азр-Зз Аар-21З 11 нс' н н ~ / н с' н с' с — с — н — н l ! н' с О Н о -1и .О-,.Н О Азр-ЗЗ Аар-213 Аар.гуэ Р и с. !.23.
Схема механизма катахиза аспартатных протеиназ, предложенная М. Джеймсам и А, Силенки !3%! с' н / С вЂ” Н. н=с О с' н ./ с — н !~ К„Н с' н / с — н // с' н н / / С вЂ” О Н вЂ” Ь~ с' Р н с.!.24. Схема механизма катынза аспартатных протенназ, предложеинаа К. Сутулой и соавт. !349] пирамидализацию атомов азота и карбонильного углерода, появление при последнем гем-гидроксильных групп, вовлеченных в водородное связывание протонированной карбокснльной группой Азр-33.
В результате образуется тетраэдрнческое промежуточное соединение. Возвращение неподеленной пары электронов к атому азота усиливает его склонность к протонизации, которая, по мнению авторов, может осуществляться двумя равновероятными способами 1392]. В одном из ннх предполагается инверсия конфигурации связей атома Х, происходящая путем поворота аминной группы субстрата на - 60' вокруг связи С вЂ” М. В результате неподеленная пара оказывается экспоннрованной в сторону растворителя, и азот легко поддается протонизации, особенно у аспартатных протсиназ с сильно кислым рН оптимумом. Альтернативный способ включает переход протона к атому Х от одной из гидроксильных групп тетраэдрнческого аддукта, находящегося в син-конфнгурации по отношению к неподеленной электронной парс азота.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
