Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Такой валентно связанный димер в физиологических условиях спонтанно принимал конформацию нативного димера н обладал идентичной с ним активностью. Этот вывод недавно нашел подтверждение в работе Т. Бхата и соавт., определивших трехмерную структуру аналогичным образом связанного димера протеиназы Н1Ч-1 с разрешением 1,8 А [383]. При замене одного из двух каталитически важных остатков Азр-25 на 01у актив= ность пропадает. К тем же результатам привело исследование 85 Таблица 12 Рвсстояння (А) мемну втомвмя боковых ценея Авр-32 я Азр-215 (нумервцня пснсннв) в крнствллосрвфяческнх структурах вспвртвтных протсянвз 62 62 032 — 0215 61 61 О32 — 0215 61 62 032 †О2 Фермент .У 7 032 С2!5 2,8 2,9 2,9 2,9 3,1 3,0 2,8 5,8 6,2 5,8 6,1 5,8 5,6 5,1 5,3 5Л 5,2 5,4 5,2 5,0 Пепснн 4,4 4,4 4,4 4,7 4,7 4,6 Ренин Пеннцнллопепснн Эндотяопепсяк Рнзопуспепснн Н!Ч-1 протеннезв КЧБ-протенназа 62 61 32 215 Фермент 32 215 Р 0 а а с„ ;„ 4,8 4,8 4,8 4,8 5,0 4,7 4,2 7,4 7,4 7,5 7,6 7,7 7,4 7,4 6,7 6,6 б,б б,б 6,8 б,б 6,4 Пепснн Ренин Пеннцнллопепснн Эндотнопепснн Рюопуспепсин Н1Ч-1 протеннвза КЧБ-протенназв К.
Диланни и соавт. валентно связанного димера Н1Ч-1 протеиназы с дипептндным мостиком Ст]у — О]у и заменой Азр-25 на Азп и С710 [384]. А. Томасселли и соавт. определили константу диссоциации нативного димера Н1Ч-1 протеиназы,которая оказалась равной 2 пМ [385]. Согласно Я. Чангу и соавт., ее величина составляет 50 пМ [382]. Несмотря на значительное расхождение найденных констант диссоцнации, можно тем не менее полагать, что димеризация Н1Ч-1 протеиназы происходит в нонамолярной области, т.е, при концентрации много ниже той, которая существует в вирусной частице, Исследование С.
Силмейера и соавт. показало, что каталитическая активность Н1Ч-1 протеиназы подавляется пепстатиновыми ингибиторами, что характерно для всех аспартатных протеиназ [386]. Там же отмечено, что замена в последовательности вирусной протеиназы остатка Азр-25 на ТЪУ ведет к полной потере активности.
Аналогичный аффект наблюдался при замене в последовательности Н!Ч-1 протеиназы остатка Азр-25 на Азп [386, 387], А1а [388, 389], Туг и Н16 [388]. Активность падает до нуля также у полонна в случае подобного мутагенеза одного из его каталитических остатков Азр [390]. Таким образом, можно утверждать, что физиологически активной является димерная форма Н1Ч-1 протеиназы, в которой каталитнчески важную роль играют оба остатка аспарагиновой кислоты [Арз-25 н Ахр-125). Лишь эта форма обладает всеми отличительными признаками аспартатных протеиназ. Следовательно, димерная форма Н1Ч-1 протсиназы, подобно пепсину, ренину, ризопус- 86 пепсину и другим ферментам данной группы, должна функционировать по типу общего основного катализа.
В какой мере вывод о едином химическом механизме каталитических реакций аспартатных протеиназ подтверждается данными рентгеноструктурного анализа ретровирусных протеолитических ферментов? В настоящее время известны трехмерные структуры трех аспартатных протеиназ ретровирусов: НГЧ-1, КЯЧ, ВМЧ и трех комплексов Н1Ч-1 протеиназы с субстратоподобными ингнбиторами 11-85548е, 1б- 365 и МЧТ-101 (табл. 1.1).
Все они являются димерами, структурно родственными друг другу н аспартатиым протеиназам из других источников. Более того, можно считать, что се известные протеиназы имеют совпадающие по геометрии активные центры (подразумевается непосредственное место сорбцни расщепляемой пептидной группировки). На это указывает количественная близость (практически совпадение) в молекулах ферментов расстояний между соответствующими атомами двух функциональных остатков аспарагиновой кислоты (табл.
1.2). Таким образом, следует заключить, что ферментативные реакции аспартатных протеиназ позвоночных, микроорганизмов и ретровирусов имеют одинаковые стартовые условия и, следовательно, должны протекать по одному и тому же, а именно основному, типу катализа. На рис. 1.18 сопоставлены кристаллографические структуры нативной молекулы Н1Ч-1 протеиназы и ее ингибиторного комплекса, а на рис. 1.19 приведена карта расстояний между атомами С' (до 10 А) двух ассоциированных молекул протеиназы. Наибольший вклад в стабилизацию димера вносят невалентные контакты двух пар Х-концевых (1 — 8, 101 — 108) н С-концевых (87 — 99, 187 — 199) фрагментов, образующих между собой многочисленные и разнообразные по своей природе контакты (дисперсионные, электростатические и посредством водородных связей).
Укладка в процессе димернзации этой плотноупакованной н, по-видимому, наиболее стабильной части Н1Ч-1 протеиназы оказывает значительное н непосредственное влияние на формирование близкорасположенного активного центра. Взаимодействия более 40 аминокислотных остатков четырех концевых фрагментов весьма избирательны, На это указывает, например, отсутствие каталитической активности у димерного комплекса, составленного из смешанных цепей вирусов Н1Ч-1 и НГЧ-2, имеющих близкую гомологию [385). Для потери активности оказалось достаточно трех замен в положениях 6, 92 и 95, поскольку на всех других участках, контактирующих в димере, последовательности ферментов двух вирусов совпадают.
В димерном комплексе Н1Ч-1 протенназы сближены также фрагменты 23 — 28 н 123 — 128, которые включают эффективно взаимодействующие между собой трниептндные фрагменты Азр-25— ТЪг-26 — СИу-27 н Азр-125 — Т(н-126 — О1у-127 — непременные учасгники активных центров всех аспартатных протеиназ. Эта контактная область двух молекул дополнительно стабилизируется невалентными взаимодействиями с остатками 7 — 9, 107 — 109 и 84 — 85, 184 — 185 соответственно Х- и С-концевых фрагментов. Наконец, есть еще одна область межмолскулярных взаимодействий 87 Р и с.
1.!8. Основные цепи нативной Н!Ч-! пратеияазы (жирная линия) и ее комилекса с ингибитором )С-365 (тонкая линия) ю лк гл ю лю лег лл лгг лгг ха Р и с. !. !9. Карта расстояний между атомами Се молекул Н!Ч-! протеиназы в димере (темные области соответствуют расстояниям < ! б А) димерной Н1Ч-1 протеиназы, Ее составляют два ф-складчатых листа, 45 — 57 н 145 — 1 57, нависающих подобно распластанным крыльям иад активным центром и получивших название "флепов" (Пар). В натнвном состоянии ферментов они не участвуют в стабилизации димерной формы и удерживают свое положение взаимодействиями сближенных по отношению друг к другу пентапептидных участков 48 — 52 и 148— 152 (рис.
1.18, 1.19), а также, по-вндимому, за счет контактов с соседним в кристаллической решетке димером. Важную роль флепы играют на стадии образования невалентного комплекса. В процессе ферментсубстратных (ингибиторных) взаимодействий происходит огромная, не имеющая прецедентов в каталитических реакциях других ферментов (во всяком случае, протеолитических) конформационная перестройка значительной части нативной структуры. Она затрагивает не только боковые цепи остатков активного центра, что обычно имеет место, но и основные цепи обеих молекул Н1Ч-1 протенназы.
Наиболыпие изменения при комплексообразовании претерпевают как раз участки 45 — 57 и 145 †1. Если судить по смещениям атомов С, то они составляют около 8,0 А у центральных остатков 50, 51 и 150, 151, постепенно затухая до 1,0 А у концевых остатков р-структур 45, 57 и 145, 157 (рис. 1.20). Встречные концы флепов смещаются к сорбированной в активном центре молекуле субстрата (ннгибитора). Заметные перемещения (2,0 — 3,0 А), также уменьшающие размеры полости активного центра, синхронно совершают фрагменты 77 — 81 и 177— 181. Смещения атомов С' у двух молекул Н1Ч-1 протеиназы в димерном комплексе близки, хотя и не идентичны.
Изменения в положениях флепов при образовании комплексов наблюдаются н у других аспартатных протеиназ. Однако, как видно из рнс. 1.20, на котором показаны смещения атомов С' в фермент-ингнбиторном комплексе ризопуспепсина, различия здесь менее значительны. Что же касается других участков основной цепи белка, то они практически не реагируют на ассоциацию с ингибитором. Большой интерес, прежде всего при поиске антивирусных лекарственных препаратов, представляет знание процесса димеризацни НГЧ-1 протеиназы.
Особого внимания здесь заслуживает вопрос о том, происходит ли ассоциация молекул без изменения нх пространственного строения, или этот процесс сопровождается конформационной адаптацией партнеров. Если изменения имеют место, то открывается возможность воспрепятствовать образованию активного комплекса путем такого целенаправленного воздействия на молекулы фермента, которое сделало бы невозможным конформационные перестройки, необходимые для их объединения. Быть может, такое направление развития антивирусной терапии окажется наиболее перспективным в силу исключительности механизма образования активных форм ретровирусных протенназ по сравнению с аспартатными протеиназамн нз других источников.
Однако непосредственно наблюдать трехмерную структуру отдельной молекулы Н1Ч-! протенназы, чтобы сопоставить ее со структурой субъединицы в днмерном комплексе, не представляется возможным, поскольку фермент кристаллизуется лишь в форме димера. Поэтому для решения 89 Ю Ю о Х з сС Ю с~ о Ю 3 Ф о ч с о о с 1 о с $ Ю Ф ФЭ ФЧ Р у ',Э вовсем.е ьинвЬвид задачи остается теоретический путь — априорный расчетконформации свободной молекулы Н1Ч-12 протеиназы по известной аминокислотной последовательности, На рис.1.21 приведены проекции пространственной структуры одной из субъединиц в нативном димерном ассоциате, на рис. 1.22 — расстояния между атомами С аминокислотных остатков той же структуры (так называемая карта Кунтца, дающая представление о сближенности остатков в конформации белковой молекулы), Из рис.
1.21 и 1.22 видно, что первые девять 19-концевых и последние шесть С-концевых остатков последовательности не взаимодействуют друг с другом и с остальной частью молекулы из-за своей удаленности. Развернутые конформационные состояния этих фрагментов наиболее благоприятны для межмолекулярных взаимодействий, которые они осуществляют в структуре каталитически активного димера Н1Ч-1 протеиназы (рис. 1.18 и 1.19).
Выше отмечалось, что именно межмолекулярные контакты четырех концевых групп двух последовательностей вносят основной вклад в стабилизацию димера. В то же время развернутые формы участков ! — 9 н 94 — 99 энергетически невыгодны для свободных молекул фермента, и их реализация в разбавленном растворе маловероятна. Следовательно, в процессе димеризации должен происходить конформационный переход от свернутых форм, выгодных для свободных молекул, к развернутым, предпочтительным для ассоциированных. Из рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
