Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Необходимой, хотя и не в полной мере достаточной, предпосылкой для его достижения является информация о трехмерных структурах соответствующих белковых молекул. В отличие от структурных исследований мембранных рецепторов, сдерживающим моментом здесь служат не трудности выделения, очистки и кристаллизации белков, а сложности более принципиального порядка. Перед рассмотрением результатов рентгеноструктурного анализа молекул протеиназы Н1Ч-1, принадлежащего к семейству РНК-содержащих вирусов Ке1гоч)гЫае, и ренина, протеолитического фермента млекопитающих, которые в последние годы привлекли к себе исключительное внимание как перспективные терапевтические мишени, несколько слов об общем состоянии исследований аспартатных протеиназ.
Молекулы аспартатных (карбоксильных) протеиназ вместе с сериновыми, цистеиновыми и металлопротеиназами образуют группу эндопептидаз, входящих в состав амидгидролаз. Они обнаруживаются у животных (пенсии, катепсин, химозин, ренин и др.), в микроорганизмах 1пенициллопепсин, эндотиапепсин, ризопуспепсин и др.) и ретровирусах (протеиназы вирусов иммунодефицита человека и обезьяны, саркомы Роуза и др.).
Аминокислотные последовательности известных ферментов этой группы обладают гомологией, особенно заметной в областях активных центров, что указывает на их эволюционное родство. 80 Первые кристаллографические структуры аспартатных протеиназ стали известны в 1977 г., когда были опубликованы данные рентгенотруктурного анализа пространственного строения молекул сразу четырех ферментов; пепснна, пеницнллопепсина. эндотиопепсина н ризопуспепсина (табл.
1.1). Структуры были идентифицированы с разрешением 2,5 — 3,0 А. Прошло около десяти лет, пока разрешение удалось довести до 1,8 — 2,1 А, которое уже с достаточной надежностью позволило судить о деталях строения самих ферментов и взаимодействующих с ними молекул ингибиторов и воды. За это время были расшифрованы структуры еще двух аспартатных протеиназ— химозина и ренина, а также структуры ряда ингибиторных комплексов четырех упомянутых выше ферментов.
Кристаллографическнй анализ показал, что, несмотря на существенное различие в последовательностях аминокислот, пространственное строение молекул аспартатных протеиназ животных и микроорганизмов сходно. Все они построены нз двух симметрично расположенных и почти целиком состоящих из Р-структур доменов.Оба домена воспроизводят одинаковый структурный мотив и содержат попадающие в активный центр фермента участки Азр — ТЬг — О(у. В контактной области домены образуют щель, пересекающую ббльшую часть глобулы белка. В центре щели находятся два каталитически важных остатка Азр-32 и Азр-215 (нумерация пепсина), карбоксильные группы которых сближены друг с другом и с несколькими другими остатками, а также с молекулами кристаллизационной воды.
Система стабилизирована сетью водородных связей, электростатическими и дисперсионными взаимодействиями (рис.!.17). Исследования трехмерных структур комплексов аспартатных протеиназ с субстратоподобными ингибиторами (табл. 1.1) позволили идентифицировать для каждого фермента места активного центра и соотнести их с участками субстрата, ответственными за первичную и вторичную специфичность ферментативной реакции. Сопсктавление структур нативных протеиназ с их ингибиторными комплексами показало, что связывание олигопептидных лигандов, незначительно отличающихся от субстратов, сопровождается поворотом одного домена относительно другого приблизительного на 4' и его смещением на - 0,3 А вдоль оси, проходящей через С'-атомы остатков Азр-32 и Азр-215.
Изменение во взаимной ориентации доменов приводит к уплотнению щели и заметной деформации активного центра — увеличению расстояния между некоторыми остатками на - 2,0 А и смещению боковых цепей до 3,5 А. Было предположено, что такие изменения необходимы для протекания ферментативной реакции и, следовательно, происходят также при образовании фермент-субстратныхкомплексов [377). Представление о чисто химических аспектах ферментативных Реакций аспартатных протеиназ сформировалось еще до становления кристаллографии белков. Детальные исследования неферментативного гидролиза разнообразных эфиров, амндов и модельных пептидов, проведенные главным образом в 1960-е годы, показали, что катализ оказывается эффективным лишь в среде. включающей следующие трн 81 Таблица 11 Реитгеиосчрукзурный анализ трехмерных структур латанных молекул асиартвтных протенивз и их нигибаторов Фермент Разрешение, А Иагабитор Лнтеразура Пенсии НРЬе(12) ТугОМе Пе псиного н Химозин Ренин Пенициллопепсии )та — Ча( — Ча1 — ЕузЬ вЂ” ОЕГ Энпотнопепагн [365) Т а б л и ц а 1.1 (окончание) Рыре1иенмс, А Литература Фермент [360, 366, 367] Р68] [369) [370) 2,5; 1,8 2,5 1,8 2,4 Ризопупаге псин Протеииаза вируса птичьега мнелобластоза (ВМЧ) Протеиназа вируса саркомы Роу (ВБЧ) Протеиназа вируса иммунолефнцита человека (Н(Ч-1) [371] 2,0 [372,373] 3,0; 2,8 [374] 2,5 [375] [376] 23 Н — Рго — РЬе — Н(з — ).ео — Еен — Туг — Туг — Бег Рго — ТЬг — Я!и — РЬе — СНзХН вЂ” РЬе — Агб — О!п Вос — ТЬг — Н — ХН вЂ” СН вЂ” СН(ОН)ХСΠ— 1.уз — РЬе 1 СНзРЬ СНзСНМез Вос — НЭ вЂ” Рго — РЬе — Н)з — Бзв.— )ео — РЬе — ХНг Ас — СΠ— Ча1 — БЬ вЂ” А1а — БгаОН Е>-Нгз — Рго — Рго — РЬе — Нгз — РЬе — Ф[СНзХН]РЬе — Ча1 — Туг Н вЂ” Ча1 — Бег — О1п — Азп — 1еп — Ф[СН(ОН)СНз) — Ча1 — Пе — Ча1 — ОН % — 85548е) Ас — Бег — 1.ев — Азп — РЬе — Ф[СН(ОН)СНз) — Рго — Пе — Ча1 — ОМе ()О-365) Ас — ТЬг — Пе — Х)е — СНзХ)о — О1п — Агб — ХНМе (МЧТ-101) 2,7; 2,3; 2,0: 1,8 3,0 1,8 2,3 2,5; 2,8 2,5; 2,4; 2,6; 2,0 2,8; 1,8 2,6; 1,8 3,0; 2,4; 2,1 2,0 1,8 [339 — 343) [344) [345, 346) [347 — 349) [350, 35Ц [35! — 354] [355 — 357] [358, 359) [360 — 362) [363) [364] о о ау-г17 С М М 617-За Се М '~,Х,г' с Р н с.
Ь! 7. Каталигически важные остатки активного ценгра аспартатнык протеиназ компонента; нуклеофил, атакующий карбонильный углерод расщепляемой пептидной связи, основной катализатор, способствующий отщеплению протонов от нуклеофила, и кислотный катализатор, обеспечивающий протонизацию уходящей группы [3781. Эти же исследования, а также изучение кинетики и термодинамики ферментативных реакций протсиназ позволили прийти к еще одному выводу общего характера— химические механизмы действия всех протеолитических ферментов могут быть сведены к двум типам: ковалентному катализу и общему основному катализу.
В первом случае инициирующим ферментативную реакцию компонентом является нуклеофил белковой молекулы, непосредственно взаимодействующий с субстратом и образующий с ним промежуточные ковалентные соединения. В реакциях протеолитического гидролиза второго типа фермент по ходу всего каталитического акта не образует ковалетных соединений с субстратом. Его нуклеофильная атомная группировка выступает в этом случае как основной катализатор, который, взаимодействуя с молекулой воды, депротонирует ее и превращает в эффективный нуклеофил, непосредственно атакующий карбонильный углерод расщепляемой пептидной связи.
Использование В.К. Антоновым и соавт.метода, основанного на га включении атома тяжелого кислорода молекулы Нг О в продукты фермснтатнвных реакций, сыграло, по-видимому, решающую роль в установлении типа каталитической реакции аспартатных протеиназ ~378— 3801. Проведенные впервые В.К. Антоновым сопоставительные исследования гидролиза, катализируемого различными амидгидролазами, показали, что сериновые и цистеиновые протеиназы функционируют по ковалентному типу, а аспартатные и металлсодержащие протеиназы— по типу общего основного катализа. Этот вывод согласуется с наиболее однозначно трактуемыми результатами химических. кинетических и термодинамнческнх исследований каталитических реакций эндопро- .,шаз, Он был подтвержден позднее данными рентгеноструктурного налива ферментов, и в настоящее время является общепризнанным. Структура аспартатиой протеиназы Н1Ч-1.
Интерес к механизму действия аспартатных протеиназ особенно возрос в последнее время в связи с обнаружением ферментов этой группы у ретровирусов, вызывающих в организмах человека н животных такие болезни, как А1138, некоторые виды лейкозов, сарком и онкоопухолей молочных желез, Самое важное здесь заключается в установлении того факта, что ставшие известными аспартатные протеиназы этих вирусов играют ключевую роль в их жизненных циклах. В клетке-хозяине они гидролизуют белки ядерных капсид, окружающих вирусные РНК, расщепляют полибелковые цепи на зрелые структурные белки и ферменты, участвующие в репликации ретровирусов. Вирусные протеиназы в состоянии также гидролизовать белки инфицированных клеток, нарушая тем самым целостность их структурно-функциональной организации. В то же время клеточные протеолитические ферменты не обладают способностью расщеплять вирусные протеиназы и выполнять их функции.
Таким образом, в отсутствие протеиназ или при их ингибировании вирусы иммунодефицита человека (Н1Ч-1, Н1Ч-2) и обезьяны (81Ч), а также опухолсродные вирусы не смогли бы приобретать инфекционные формы. По этой причине протеиназы ретровирусов стали объектами пристального внимания энзимологов и медиков. Аспартатные протеиназы ретровирусов сразу же после их открытия начали интенсивно исследоваться и через 2 — 3 года стали одними из наиболее тщательно изученных ферментов. Основное внимание было уделено аспартатной протеиназе Н[Ч-1, о структуре и функции которой сейчас известно, пожалуй, больше, чем о таком классическом объекте, как пепсин, открытом еще в 1836 г. Последовательность НГЧ-1 протеиназы состоит из 99 аминокислотных остатков, тогда как аспартатные протеиназы позвоночных и микроорганизмов содержат их более трехсот.
В ней встречается фрагмент Азр — Тпг— 61у, присутствующий в каждом домене у всех пепснноподобных ферментов. Л. Перл и У. Тейлор предположили, что физиологически активная форма Н1Ч-1 протеиназы включает две молекулы, ассоциированные посредством невалентных взаимодействий [381]. Я. Чанг и соавт. проверили это предположение экспериментально [382]. Методами генной инженерии была синтезирована полипептидная цепь из 203 аминокислотных остатков, составляющих две молекулы Н1Ч-1 протеиназы, С- и Х-концы которых соединены пентапептидным участком О1у — О[у — Бег — 8ег — О1у.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
