Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Во-вторых, из выделенных белковых молекул следует получить, не нарушив нх пластической, легко дсформирующейся при изменении внешних условий структурной организации, высокоупорядоченный монокристалл требуемых размеров, что не всегда удается даже в случае водорастворимых Днмер спектрина Димер бенк полосы й! пндныи Днмер белка полосы а Гпнкофорнн б"спой ри с. 1.5, Схема структурной организации молекул спсктрина на внутренней 0!итопвазматичсской) поверхности мембраны эритроцитов человека Гпнкофорин Белок полосы П! некпеточное ространстео Ч Й 1И Цитоппазма НО ри с.
1.6. Схема расположения тликофорина и белка полосы Н! в мембране зритроцитов человека глобулярных белков, В 80-е годы ХХ в. возник альтернативный подход к получению белковых объектов для рентгеноструктурного анализа, который затронул н кристаллографические исследования мембранных белков. Речь идет о генной инженерии, в основе которой лежит сайтспецифическая рекомбинапия ДНК. В результате стало возможным 59 создавать целенаправленные, в том числе и искусственные, генетические программы и получать требуемые белки и их фрагменты в количествах, достаточных не только для научных, но и прикладных целей. Методы генной инженерии, однако, радикально не облегчили получение кристаллических образцов, построенных из нативных конформаций белковых молекул и имеющих четкие дифракцнонные картины.
Тем не менее, появившаяся перспектива получения химически чистых мембранных белков, их мутантов и составных частей любой длины и с любой вариацией аминокислотных последовательностей, значительно расширила область поиска решений этой задачи. Липидный анапой Р и с. Ь7. Структура молекулы бактериоролопсина и липилном бислое а-сп Внекпеточ пространс До недавнего времени единственным мембранным транспортным белком, для которого были известны некоторые детали его трехмерной структуры, полученные с разрешением около 7,0 А, был бактериородопсин, обнаруженный в плазматической мембране пурпурной бактерии На!оЬасуепшп Ьа!оЬппп. Его полипептидная цель состоит из 248 остатков.
В каждой молекуле бактериородопсина имеется одна поглощающая свет простетическая группа — ретиналь, идентичный хромофору родопсина палочек сетчатки глаза у позвоночных. Бактериородопсин работает как фотоактивируемый протонный насос. При активации одним квантом света возбужденный хромофор вызывает конформационные изменения в белке, в результате чего два протона переносятся с внутренней поверхности клетки на наружную.
В мембране создается градиент концентрации протонов и градиент электрического потенциала, которые обусловливают синтез АТР. Молекулы бактериородопсина в мембране образуют плоскую кристаллическую решетку, подобную двухмерному кристаллу, Р.Хендерсон и П. Анвин 12451 использовали для определения трехмерной структуры белка и его ориентации в мембране сочетание методов электронной микроскопии низкой интенсивности (см.
гл. 6) и малоуглового рентгеновского рассеяния. В результате рекордной для обоих методов точности идентификации пространственного строения молекулы было показано, что полипептидная цепь бактериородопсина образует в мембране семь а- спиралей, каждая из которых содержит около 30 аминокислотных остатков (рис. 1.7). Все спирали пересекают липидный бислой примерно 60 под прямым углом к плоскости мембраны.
Они плотно упакованы и не оставляют места в канале для молекул воды. Поэтому протоны, повидимому, проходят через мембрану по цепочке взаимодействующих друг с другом белковых цепей а-спиральных остатков, действие которьзх инициируется возбужденным хромофором. Значительная часть мембранных белков является рецепторами, т,е. аллостсрическими белками, обладающими способностью при взаимодействии с гормонами — специфическими сигнальными медиаторами— определенным образом перестраивать пространственную структуру молекулы. Аллостерическое изменение конформации передается по трансмембранной цепи сопряженных брелков или доменов одного большого белка внутрь клетки, достигает воспринимающей посланный сигнал системы и стимулирует в ней соответствующий физиологический процесс.
Имеющаяся информация о трехмерных структурах рецепторов и других составляющих трансмембранных белков крайне скудна. До недавнего времени удалось получить кристаллы и определить структуру только двух специфических мембранных рецепторов, фоторецепторного центра и порина 1246-248). В 1990-е годы исследования рецепторных белков начинают приобретать систематический характер. Полученные к настоящему времени сведения об их пространственном строении, как показано ниже, относятся нс к структурам целых мембранных рецепторов, а лишь к внешним частям молекул, внеклеточным доменам. Структура комплекса гормона роста человека (ЬСН) с внешней частью рецептора (ЬСНЬр).
А. де Вас и соавт. методом рентгеновской кристаллографии с разрешением 2,8 А установили пространственное строение белкового комплекса лиганда ЬСН с внеклеточным доменом рецептора ЬСНЬр, взаимодействие которых активизирует рост и метаболизм клеток мышечной, хрящевой и костной тканей [2498 Молекула мембранного рецептора ЬСНЬр состоит из трех пространственно четко разделенных друг от друга частей; внеклеточного, расположенного на внешней стороне мембраны, гормонсвязывающего фрагмента из 246 аминокислотных остатков, пронизывающего липидный бислой трансмембранного сегмента и внутриклеточной части, функция которой пока не ясна. Отсутствует также четкое представление о механизме взаимодействия всех частей между собой и передаче сигнала, следующего за ассоциацией гормона с внешней частью рецептора, внутрь клетки.
Рентгеноструктурный анализ гормон-рецепторного комплекса показал,что внеклеточная белковая цепь молекулы ЬСНЬр образует два хорошо различимых домена, состоящих из фрагментов 1-123 и 128- 238, соединенных лабильным участком 124-127. Каждый домен содержит семь |)-тяжей, образующих сэндвичевую структуру. Большое значение в реализации гормональной функции авторы 1249) отводят С- концевому октапептидному участку 239 — 246.
При сорбции субстрата он обеспечивает необходимую для образования эффективных невалентных контактов конформацнонную подвижность двум доменам 61 рецептора. Помимо этого, он способствует сближению внеклеточной части одного рецептора с такой же частью другого и тем самым привлекает два аналогичных внешних домена последнего к связыванию гормона. В результате образуется комплекс ЬОН[ЬОНЬр)ь в котором оба рецептора взаимодействуют с гормоном практически одинаково, несмотря на то, что два центра связывания молекулы ЬОН с парами доменов двух рецепторов не имеют полного структурного сходства.
Пространственное строение комплекса ЬОН(ЬОНЬр)з внешне напоминает комплекс антнгена с двумя парами доменов (гаЬ) нммуноглобулина. Структура внеклеточного домена аспартатного рецептора бактерии Яа1шопе11а 1урЬпппгшш и его комплекса е лигандом. Пространственное строение домена в свободном состоянии рецептора и ассоциированном с аспартатом было определено М. Мильбурном и соавт, с разрешением 2,4 и 2,0 А соответственно [250). Молекула аспартатного рецептора.
типичного трансмембранного белка, состоит из трех частей: внешнего лигандсвязывающего домена, цитоплазматнческого сигнального домена и находящегося в липидном бислое промежуточного домена [251-254 8 Периплазматический участок белковой последовательности 31 — 188, содержащий Азр-связывающий центр, соединен двумя пронизывающими мембрану пептидными фрагментами 7-30 и 189 — 212 с внутренним, самым большим доменом, который образуют остатки 1-6 и 213-552 [255, 256[. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена 31 — 188 была синтезирована генно-инженерным методом [257).
Очищенный полипептид кристаллизовался исключительно в виде димера, обладавшего тем же сродством к аспартатному лиганду, что и весь белок дикого типа. Дифракционная картина, имевшая вначале диффузный характер, приобретала более резкие очертания прн сшивке двух цепей димера посредством дисульфидной связи, образованной остатками Суз в положениях 25 и 35.
Приготовленный таким образом препарат по своим функциональным свойствам не отличался от домена нативного рецептора. Трехмерные структуры субъединиц димера, не ассоциированного с лнгандом, идентичны и имеют вид, схематически представленный на рис. 1.8. Каждая из них состоит нз четырех а-спиралей, образующих цилиндр диаметром около 20 А и длиной более 70 А.
Дисульфидсвязанный димер принадлежит к группе симметрии Сз„. При взаимодействии с лигандом и комплексообразовании симметрия нарушается. Центр связывания аспартата с рецептором находится вблизи вершины днмера между контактными поверхностями субъединиц на высоте более 60 А от предполагаемой поверхности внешнего фосфолипидного слоя мембраны. В соответствии со своей симметрией димер, образованный нз внеклеточных доменов двух рецепторов, имеет два лигандсвязывающнх гидрофильных кармана. Один нз них, наиболее четко проявляющийся на картах электронной плотности, показан на рис. 1.9. Он включает остаток Агд-64 и фрагмент 149-1 54 одной субъединицы я остатки Аг8-69, Агд-71 — другой, а также молекулу кристаллизацнонной 62 Ри с.
!.а, Ленточная схема трехмерной структуры виеклеточиого домена аспартатсвязывающего рецептора (250! а2 а4 Р и с. ртк Схема воцородных связей аспарагиновой кислоты с лигандсвязывающим центром, образованным внеклеточными доменами двух аспартатных рецепторов (250! Аминокислотные осгаз кн ояного из них заключены в прямоугольные рамки, а Лругого — н овальные :, г Г' воды, которые в лиганд-рецепторном комплексе образуют с аспартатом сложную сеть водородных связей. Сорбция двух молекул аспартата вызывает сближение остатков, формирующих гидрофильные карманы, и общее уплотнение димерного комплекса.
Среднеквадратичное отклонение атомов С' одной субъединицы (без учета фрагмента 77 — 85) составляет 0,47 А, а атомов С второй субъединицы (без учета фрагмента 63 25-36) — 0,34 А. Отклонения С' на участках 77-85 н 25 — 36 заметно превышают указанные величины. Конформационные изменения днмера при аспартатном связывании приводят к вращению субъединицы на 4' относительно короткой оси, которая приблизительно перпендикулярна оси второго порядка и контактирующим поверхностям лигандсвязывающих доменов. В какой мере отмеченные конформационные отклонения отражают целенаправленный аллостерический эффект рецептора осталось пока невыясненным. Структура простагландин-Нз-синтазы (РОНЯ). Вырабатываемые железами внутренней секреции гормоны попадают в кровь и с ее током достигают различных органов и тканей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
