Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Рассмотрение, вероятно, поможет составить представление о состоянии и возможностях рентгеновской кристаллографии белков первой половины 1990-х годов. Для того чтобы с хорошим разрешением получить трехмернукз структуру белка и увидеть расположение сотен или тысяч его неводородных атомов, необхддимо иметь большие кристаллы с высокой степенью упорядоченности. Природа не наделила белковые молекулы свойством спонтанно создавать регулярные макроскопические структуры. В есгесгвенных условиях они не образуются; их нет в клетках и живых организмах. Поэтому получение из белков монокристаллическнх образцов в лабораторных условиях, как правило, — самый длительный этап рентгеноструктурного анализа, который может продолжаться годами и закончиться безрезультатно. Именно так до недавних пор завершались все попытки закристаллизовать мембранные белки, которые все это время оказывались как бы вне компетенции рентгеновской кристаллографии, десятилетиями объектами рентгеноструктурного анализа оставались водорастворимые глобулярные белки.
55 3.1, МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ Одно из самых значительных достижений рентгеноструктурного анализа белков последних лет, которое не может не повлиять на дальнейшее развитие биологии и становление ее новой области— молекулярной биологии клетки, состоит в начавшейся расшифровке трехмерных структур первых мембранных белков, 11сред обсуждением полученных здесь результатов целесообразно кратко сообщить о том, что было известно об этих белках до исследования их с помощью рентгеновской дифракции. Если основные структурные особенности биологических мембран определяются молекулами липцдного бислоя, то специфические функции мембран выполняются главным образом белками.
Они ответственны за процессы превращения энергии, выступают в качестве рецепторов и ферментов, образуют каналы активного и пассивного транспорта молекул и ионов различных веществ через мембраны, охраняют организм от проникновения чужеродных антигенов и сгимулируют иммунный ответ клеточного типа. В обычной плазматической мембране белок составляет около 50% ее массы. Однако в некоторых мембранах, например во внутренних мембранах митохондрий и хлоропластов, его содержание поднимается до 75%, а в других, например миелиновой мембране, снижается до 25%. Многие мембранные белки пронизывают липидный бислой насквозь и контактируют с водной средой ло обеим сторонам мембраны.
Молекулы этих белков, называемых трансмембранными, как и окружающие их молекулы липидов, обладают амфипатическими свойствами, поскольку содержат гидрофобные участки, взаимодействующие внутри бислоя с гидрофобными хвостами липидов, и гидрофильные участки, обращенные к воде с обеих сторон мембраны. Другая группа мембранных белков соприкасается с водой только с одной стороны бислоя [234, 2351. Одни из них погружены только во внешний или во внутренний слой мембраны, другие ассоциированы за счет невалентных взаимодействий с трансмембранными белками, третьи прикреплены к мембране с помощью ковалснтно связанных с ними цепей жирных кислот, внедренных в липидный слой. В 1979 г.
было показано, что белки плазматической мембраны способны к вращательной диффузии — поворотам вокруг оси, перпендикулярной плоскости бислоя, и самопроизвольному передвижению вдоль плоскости самой мембраны, что получило название "латеральной диффузии". Однако белки не могут совершать так называемые флипфлолы, т.е. перевертываться и перескакивать с одной стороны бислоя на другую. Латеральная диффузия позволяет мембранным белкам совершать перемещения по мембране и взаимодействовать между собой, а также обеспечивает распространение мембранных компонентов из мест их синтеза в другие области клеток.
Текучая структура липидного бислоя дает возможность мембранам сливаться, не утрачивая способности к регуляции их проницаемости и реализации специфических функций. Благодаря динамическим свойствам мембран ассоциированные с „ими белки поддаются отделению от липидов. Иногда эта операция довольно проста и совершается в мягких условиях, например путем экстракции соленым раствором. Освобождаемые таким образом мембранные белки называются периферическими. В других случаях, ,п,сающихся обычно трансмембранных белков, выделение более сложно и ие всегда заканчивается удачно.
Многие белки, получившие по способу их очистки название "интегральных", удается выделить только после полного разрушения бислоя с помощью детергентов и органических растворителей ]236]. Детергенты — это небольшие по сравнению с белками амфипатическис, дифильныс молекулы (додецилсульфат натрия, тритон и др.), состоящие из полярной и неполяриой частей. При смешивании детергента с мембраной неполярные, гидрофобныс, концы его молекул взаимодействуют с липидами и, разрушая их ассоциацию с белками, связываются с гидрофобными участками последних, благодаря чему их полярные, гидрофильные концы оказываются ориентированными в водную среду. Солюбилизированные мембранные белки, приобретя способиосгь растворяться в воде, переходят в раствор в виде комплексов с детергентом.
При его удалении белки эту способность теряют и выпадают в осадок, образуя смесь различных белков. Как правило, мембраны предварительно прогревают до 100' в 1%-ном растворе сильного детергента, что приводит к разрушению всех нековалентиых белок-белковых и бслоклипидных взаимодействий. А. Гелениус и К. Симоне разработали метод разделения белков путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии детергента (додецилсульфата натрия) [236].
В свое время это был прорыв в исследовании мембранных белков, приведший к их химической идентификации, классификации и выделению главных белков, присутствующих в различных мембранах. Дальнейшая работа с мембранными белками — изучение их функций, механизмов действия и пространственных структур, однако, натолкнулась на большие трудности. Оказалось, что высвобождение белковых молекул из мембраны часто сопровождается необратимой денатурацией их нативных структур и, следовательно, потерей активности.
В редких благоприятных случаях при солюбилизации белков в мягких условиях и при низких концентрациях функциональные свойства не пропадают, что указывает на сохранение, по крайней мере частичное, нативных конформаций. Наиболее детальная информация о белках и липидном бислое получена при изучении плазматической мембраны эритроцитов человека, содержап1их гемоглобин немембранный белок, представленный в этих клетках в наибольшем количестве ]237], удобство данного объекта обусловлено тем, что мембраны эритроцитов, называемые "тенями", являются единственными в клетке и их легко выделить в чистом виде с разрывом и без Разрыва и даже получить вывернутыми наизнанку.
При изучении теней эритроцитов впервые удалось установить, что некоторые мембранные 6~яки пронизывают насквозь мембранный бислой, а внешняя н внутренняя стороны мембраны являются асимметричными (238]. Исследования белков плазматической мембраны эритроцитов человека методом одномерного электрофореза в полнакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия привело к идентификации около 15 главных белков с молекулярными массами от 15 до 250 кДа. Три из них — спектрин, гликофорин и так называемый белок полосы И1— составляют в сумме более 60% от массы всех мембранных белков клетки.
Они по-разному связаны с мембраной и могут служить примерами трех типичных способов ассоциации белков с мембранами. Спектрин (240 кДа) в равной мере можно считать и мембранным белком, и компонентом цитоскелета эритроцитов. Две его полипептидные цепи, закрученные друг относительно друга, образуют подвижные димеры, которые посредством взаимодействий с короткими актиновыми филаментами и другими белками обьединены в тетрамеры, покрывающие плотной сетью цитоплазматическую поверхность мембраны (рис. 1.5). Структурная организация позволяет спсктрину регулировать подвижность белков и их распределение в плазматической мембране ~239, 240], Гликофорин — первый мембранный белок, для которого была определена аминокислотная последовательность.
Этот трансмембранный гликопротеин содержит 131 аминокислотный остаток и около 100 остатков сахара; его молекулярная масса равна 30 кДа [241). Из рис. 1.6 видно, что ббльшая часть полнпептидной цепи гликофорина находится на наружной поверхности мембраны, где локализован гидрофильный Х-концевой фрагмент. С-Концевой участок цепи, также составленный преимущественно из гидрофильных остатков, погружен в цитоплазму, а гндрофобный фрагмент в форме единичной а-спирали из 20 аминокислотных остатков пронизывает неполярный липидный бислой.
Белок полосы 111 из мембраны эритроцитов человека представляет собой трансмембранный белок с молекулярной массой около 100 кДа (примерно 800 аминокислотных остатков). Это транспортный белок, две молекулы которого образуют анионный канал для ионов С1 и НСОз, пассивно перетекающих через мембрану в соответствии с градиентами их концентраций (242-244). Полипептидная цепь белка в а-спиральной конформации несколько раз пронизывает бислой; около трети его цепи с Х-конца помещена в цитоплазму, а короткий С-концевой участок расположен во внеклсточном пространстве (рис. 1.6).
Для того чтобы понять механизм функционирования транспортного белка полосы [11, как и механизмы действия других мембранных белков, необходимо знать трехмерную структуру молекулы в условиях липидного бислоя. Для получения такой информации требуется, на первый взгляд, почти невозможное. Во-первых, необходимо отделить трансмсмбранный белок от липидов и других мембранных белков, не повредив его молекулярной трехмерной структуры, что очень трудно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
