Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Остальные остатки входят в неупорядоченные участки. Обрыв а-спиралей в миоглобине происходит, как правило, вблизи остатков пролина, серина и треонина, которые, согласно конформационной гипотезе Блоута, относятся к спираленеобразующим. Структура гемоглобина с низким разрешением (5,5 А) была получена Перутцем и соавт.
в 1960, а с высоким разрешением (2,2 А)— в 1968 г. (рис. 1.2) [206-208]. Таким образом, был закончен труд, продолжавшийся около 30 лет. Напомним, что эта работа была начата Перутцем в то время, когда расшифровка структуры обычной органической молекулы из 10-15 атомов была трудноосуществимой задачей, а сама постановка исследования пространственного строения биологической молекулы, состоящей из многих тысяч атомов, представлялась фантастической даже специалистам. Молекула гемоглобина построена из 574 аминокислотных остатков и содержит около 10 000 атомов.
Она имеет четвертичную структуру и состоит из четырех глобул: двух а- н двух Д-субъединнц, содержащих соответственно 14! и 146 аминокислотных остатков. Между а- и 8-субъединицами существует значительная гомология; близки также нх конформации. Молекула гемоглобина имеет сферическую форму с диаметром- 55 А. Оказалось, что а- н 8-цепи гемоглобина похожи на цепь миоглобина. Это был интересный и многозначительный факт. Гемоглобин был взят у лошади, а миоглобин — у капзалота. Таким образом, структуры двух белков из разных типов клеток и разных животных, но обладающих сходной функцией, имели близкое пространственное строение.
Анализ третичных структур миоглобина и гемоглобина позволил сделать ряд наблюдений, имеющих, как тогда казалось, общее значение. Расположение неполярных и полярных аминокислотных остатков в а-спиралях и взаимная ориентация спиралей в глобуле таковы, что неполярные осгатки, в согласии с концепцией У. Козмана, оказываются в значительной мере экранированными от контактов с водой, а полярные, напротив, взаимодействуют с молекулами воды [209,210].
47 Р и с. 1.1. Модель трехмерной структуры миоглобнна Р и с. 1.2. Модель трехмерной структуры гемоглобина Плотноупакованные остатки с неполярными боковыми цепями находятся во внутренних частях глобул миоглобина и а- и р-субъединиц гемоглобина. Их число составляет приблизительно половину общего количества неполярных остатков. Многие остатки глицина и аланина располагаются на поверхности глобулы.
Остатки с объемными гидрофобными боковыми цепями, не попадающие во внутреннюю часть, спрятаны от контактов с водой в щелях, образованных цепями вблизи поверхности. Все это находилось в полном соответствии с развитым Козманом представлении о гидрофобных взаимодействиях. Подавляющее большинство полярных остатков (в миоглобине, например, исключение составляют лишь 5 остатков из 77) находится на поверхности. Напрашивается вывод, что полярные и неполярные остатки располагаются в аминокислотной последовательности таким образом, что, с одной стороны, они осуществляют взаимодействия, стабилизирующие отдельные спиральные формы, насыщенные водородными связями, а с другой — обеспечивают термодинамически выгодные контакты между спиралями и взаимодействия спиралей с внешней средой.
Иными словами, в глобуле имеет место взаимная стабилизация вторичных и третичных структур, Ионные пары в белках находятся в водном окружении, так как при их образовании освобождаются ориентированные молекулы воды, окружающие заряженные группы, При образовании ионных пар, как установил Козман, энтропия воды возрастает и понижение за этот счет свободной энергии более значительно, чем выигрыш энергии при чисто кулоновском взаимодействии молекул воды с изолированными полярными группами 1210).
Изучение М. Перутцем, Дж. Ксндрью и Г. Уотсоном гемоглобинов различных видов позвоночных (приматов, лошади, свиньи и др.) и миоглобинов кашалота и человека показало, что в подавляющем большинстве случаев наблюдаются эквивалентные в отношении природы боковых цепей замены остатков [21 Ц. Рассмотрев характер замещений в аминокислотных последовательностях при филогенезе, авторы отметили неодинаковую структурную роль остатков. За правильное свертывание белковой цепи в нативную конформацию ответственны остатки, оказывающиеся при свертывании цепи внутри глобулы, а не экспонированные к растворителю.
Работы Перутца и Кендрью, благодаря которым впервые стали известны на атомном уровне трехмерные структуры двух глобулярных белков, дали блестящее и как будто бы бесспорное доказательство справедливости предположения, высказанного еще Астбери и господствующего в молекулярной биологии в течение десятилетий, о единстве структурных элементов глобулярных и фибриллярных белков и синтетических полнпептидов. Третичные структуры миоглобина и гемоглобина явились подлинным триумфом а-спиральной концепции По- линга — Кори. В сложных, лишенных внешней симметрии молекулярных конформациях этих белков а-спираль действительно оказалась доминиРующей структурой.
После расшифровки строения многлобина и гемоглобина для многих исследователей концепция Полинга — Кори пред- 49 сгала уже не как весьма правдоподобная и полезная рабочая гипотеза, а как не вызывающий никаких сомнений принцип пространственной организации белковых молекул. Эта концепция послужила основополагающей идеей поиска эмпирических правил свертывания полипептидной цепи с известной последовательностью. 2.3. ТРЕХМЕРНАЯ СТРУКТУРА ЛИЗОЦИМА Первым ферментом, у которого была выяснена третичная структура и каталитические свойства которого были рассмотрены на основе знания расположения атомов в активном центре, был лизоцим. Его химическое строение установлено П. Жолле в 1962 г., а несколько позднее Р.
Кенфилдом, Фермент, выделенный из яичного белка, представляет собой одну полипсптидную цепь из 129 аминокислот. Расшифровка структуры белка была начата Филлипсом и соавт. в!960 гл через два года было получено изображение с малым разрешением 6,0 А [212-2140 В 1965 г. выполнен расчет структуры при учете около 10 000 рефлексов с разрешением в 2,0 А [215-2181. Трехмерная структура лизоцима имеет форму эллипсоида с осями — 45 х 30 х 30 А, Она содержит лишь несколько коротких, сильноискаженных и с трудом узнаваемых спиральных участков [рис. 1,3).
Пептидные группы в них, как правило, повернуты таким образом, что связи С=О направлены наружу по отношению к оси спирали, а Х вЂ” Н вЂ” внутрь. В результате такого поворота связи Х вЂ” Н попадают в промежуток между карбонильными группами третьего и четвертого остатков и, следовательно, не образуют оптимальных водородных связей. В ряде мест псптидная цепь скручена таким образом, что получается структура, промежуточная между а-спиралью и спиралью 3пь В молекуле лизоцима имеется короткий участок антипараллсльной 0-структуры. Более половины всех аминокислотных остатков входят в полностью нерегулярные структуры. Таким образом, лизоцим в отношении вторичных структур существенно отличается от миоглобина и гемоглобина; его спиральные участки содержат не три четверти остатков, как в случае миоглобина, а менее четверти, причем и они, как отмечалось, имеют нерегулярную форму, Поэтому здесь уже нельзя сказать, что третичная структура белка практически полностью определяется способом укладки регулярных вторичных структур.
Некоторые особенности строения лизоцима, однако, согласуются с теми, которые были отмечены у ранее исследованных белков. Остатки с полярными боковыми цепями находятся, как правило, на поверхности глобулы и взаимодействуют с молекулами воды. Некоторые остатки защищены от контактов с окружающей средой и взаимодействуют между собой, образуя гидрофобные кластеры. Условия, в которых находятся молкулы в кристаллическом белке, в сущности незначительно отличаются от естественных условий в клетке. Кристаллы включают около 35% по массе (50% по объему) жидкости, главным образом воду. Поэтому, как отмечает Филлипс, Р и с. 1ек Трехмерная структура фермеит-иигибиториого комплекса лизоцима йв Иа Нз Нг йз ОНА В ОНС 0 ' СНЕ Е Н з С вЂ” С 3 Н Н Н С Н Р и с. 1иь Фрагмент полисахарида, содержащегося а оболочках бактериальных клеток, — субстра г лизоцима А, С, Š— остатки М ацсз ивгвюхозамизза (М ЛО, В, О.
Р— ею втки М ацстивмурамовоа кисхщы 1НАМ). Фермент расщецввс з связь мсжху «свызами О и Е конформационное состояние белка в кристалле должно быть близким к состоянию в растворе ~217]. Д. Филлипс и соавт. также впервые получили в 1967 г, структуру фермент-ингибиторного комплекса с хорошим разрешением 1219 — 2211. Так как фсрментативный каталитический акт является быстрым процессом, то исследовать непосредственно структуру фермент-субст- 51 ратных комплексов с помощью рентгеновской дифракции не представляется возможным. Д.
Филлипс получил кристаллы устойчивого невалентного фермент-ингибиторного комплекса лизоцима с три-Х-ацетилглюкозамином (01сХАс). Молекулы соединения легко диффундируют внутрь белкового кристалла по пронизывающим его каналам, заполненным водой, и располагаются в активных центрах молекул фермента. Отправным моментом исследования были данные В. Венцеля, обнаружившего, что фермент становится неактивным в присутствии 0)сХАс, Эта молекула является частью гексасахарида, который в обычных условиях расщепляется ферментом. Естественно было предположить, что 01сХАс, действуя как конкурентный ингибитор, присоединяется к ферменту таким же образом, как соответствующая часть молекулы субстрата.
Полученные результаты оказались весьма интересными. Во-первых, было выяснено место посадки трисахарида. Молекула 01сХАс заполняет верхнюю половину щели активного центра, связываясь с ферментом эа счет слабых невалентных взаимодействий и водородных связей. Во-вторых, было показано, что образование невалентного комплекса сопряжено с конформационными изменениями фермента. Из дифференциальной картины, фиксирующей различия в распределении электронной плотности нативного фермента и его комплекса, отчетливо были видны смещения боковых цепей некоторых остатков и сужение щели при связывании 01сХАс. Необходимость изменения конформаций ферментов в процессе каталитического акта неоднократно обсуждалась в литературе и до этого. Однако впервые удалось наблюдать изменения структуры белка экспериментально и оценить их количественно. Молекула 01сХАс занимает только половину активного центра фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
