Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Выше отмечалось, что в это время для инсулина одновременно несколькими авторами были предложены совершенно различные, но практически полностью а-спнральные структуры. Даже для рибонуклеазы считалось, что регулярное свертывание боковой цепи в нативной конформации нарушается лишь в местах включения в аминокислотную последовательность остатков пролнна [предполагалось, что только из-за невозможности образования водородной связи 5-~1) и цисгеина. Вторым методом, предложенным Берналом для решения фазовой проблемы рентгеносзруктурного анализа белков, был метод нзоморфного замещения [180]. В той форме, в какой он применялся кристаллографами-органиками, его нельзя было использовать для белков из-за трудности получения гомогсннозамсщенных молекул.
Дж. Бернал исходил не из валентного связывания тяжелого атома с молекулой, как это делали Дж. Робертсон и И. Вудворд [173], а из специфического невалентного взаимодействия тяжелого атома с белком, определяемого характером профиля его потенциальной поверхности. Строго говоря, речь шла не о замещении тяжелым атомом, а о его присоединении. Оказалось возможным связать тяжелый атом с поверхностью белка без нарушения его молекулярной кристаллической структуры. Это удалось сделать Брэггу н Псрутцу, которые получили изоморфные производные кристаллов нативного гемоглобина путем диффузии тяжелых атомов [194]. Тяжслыс атомы (Н8, Рд Ап, 1) и др.), присоединенные к молекуле белка, не только создают на рентгенограмме новые рефлексы, но, обладая значительной электронной плотностью и большой рассеивающей способностью, изменяют интенсивность белковых рефлексов.
Изменение интенсивности зависит от взаимного расположения тех или иных фрагментов белка и тяжелых атомов. Различие в интенсивностях отраженных лучей в дифракционных картинах натнвного белка и его производных делает возможным, если известны положения тяжелых атомов, определение фазовых значений рефлексов.
Применение производных белка, содержащих несколько тяжелых атомов, позволяет решить проблему фаз однозначно. Необходимым условием является полное сохранение структуры белкового кристалла при введении тяжелых атомов. Метод нзоморфного замещения был использован Брэггом и Перутцем для расчета знаков рефлексов в дифракционной картине гемоглобина. Описание деталей этого исследования содержится в работе д, Грина, В. Ингрэма и М. Перутца ~195). После создания метода, позволившего решить в кристаллографии белков проблему фаз и преодолеть трудности получения нужных кристаллов нативного белка и его изоморфных производных, встала задача измерения ингенсивносгей отражений в дифракционной картине.
Она также не имела аналогий, поскольку касалась измерений, несопоставимых с кристаллографией малых молекул по числу дифрагированных лучей, многие из которых малоинтенсивны. Ощутимый прогресс в решении этой задачи наступил только в конце 1960-х годов, после создания полностью автоматизированных дифрактометров. В последующие годы сцинтилляционные счетчики, способные регистрировать отдельные кванты рентгеновского излучения, были соединены с прибором, автоматически перемещающим кристалл и детектор с одного дифрагированного луча к другому, что привело к достаточно эффективной и точной регистрации интенсивности. В последнее время усовершенствование эксперимента направлено на создание источников рентгеновского излучения повышснной яркости и монохроматичности.
Однако при этом возрастает опасность радиационного разрушения образца, вполне реальная в кристаллографии белков. Обработка данных, полученных при измерении интенсивностей огромных массивов отражений, была бы просто немыслима без использования электронной вычислительной техники. Кроме того, в ходе вычислений необходимо введение поправок на фон, на фактор Лорентца, учитывающий относительное время нахождения каждой узловой плоскости в отражающем положении, на фактор частичной поляризации дифрагированного луча, если подающий луч не поляризован, на поглощение, радиационное разрушение кристалла и т.д.
Необходим также контроль за вычисленном и устранением ошибок случайного характера. Работа по расшифровке трехмерных структур белков, начатая до появления вычислительной техники, не была бы доведена до конца, если бы такая техника не была создана во второй половине 1950-х годов. Увеличение темпа ренттеноструктурных исследований в последнее время во многом обусловлено развитием вычислительной техники, возможностью использования быстродействующих ЭВМ с болыпим объемом памяти и совершенными программами. Изображение, полученное после математической обработки измерений дифракционной картины, отражает распределение электронов в кристалле.
Обычно вычисляют электронную плотность в каком-то регулярном множестве точек н соединяют точки одинаковой электронной плотности линиями, получая таким образом плоские контурныс карты. Расположенные в определенном порядке карты, вычерченные на прозрачных пластинках, передают распределение электронной плотности в трехмерном пространстве. Количество деталей структуры, видимых на таком изображении, зависит от количества рефлексов, использованных для построения контурных карт. При включении в 45 анализ почернений, вызванных рассеянием рентгеновских лучей под большими углами, можно видеть атомы, которые на картах электронной плотности выступают в виде отдельных пиков.
При меньшем разрешении видны только группы атомов, имеющие характерное распределение электронной плотности, по которому их можно распознать. Интерпретацию карт, как правило, проводят с помощью механических атомных моделей. Точность их изготовления достаточна для воспроизведения стандартных длин связей и валентных углов, найденных в рентгеноструктурных исследованиях отдельных аминокислот и простейших пептидов. Узнавание аминокислотных остатков в белке почти всегда основывается на данных о последовательносги аминокислот, определенной с помощью химико-ферментативных методов или приемов генной июкенерии. Для углубленного ознакомления с теорией и современной методологией кристаллографии белка могут быть рекомендованы книги Т.
Бландела и Л. Джонсона [ 19б[ и Д. Макри [197'ь 2.2. ТРЕХМЕРНЫЕ СТРУКТУРЫ МИОГЛОБИНА И ГЕМОГЛОБИНА Выше отмечалось, что развитие рентгеноструктурного анализа белков получило необходимый импульс в 1954 г., после того как Брэгг и Перутц впервые использовали метод изоморфного замещения для расчета знаков рефлексов в рентгенограммах гемоглобина [1941. Однако не гемоглобин оказался первым белком, трехмерная структура которого стала известной.
Вследствие меньшего размера, а также благодаря более счастливому случаю с нахождением изоморфных производных и их кристаллизацией таким белком стал миоглобин. Молекула миоглобнна состоит из 153 амннокислотных остатков (около 2500 атомов), образующих одну полипептидную цепь. К свернутой цепи прикреплена порфириновая плоская группа гема с атомом двухвалентного железа в центре, к которому и присоединяется молекула кислорода.
Рентгеноструктурное изучение молекулы миоглобина, начатое Кендрью в 1948 г., проводилось в два этапа [198. 1991. Вначале в расчет было принято неболыпое число рефлексов — несколько сотен. Этого оказалось достаточно для того, чтобы построить модель молекулы с низким разрешением. Такая модель с разрешением 6,0 А была получена в 1958 г. Кендрью н соавт. [200, 201[, На ней нельзя было обнаружить не только отдельные атомы, но и боковые цепи аминокислотных остатков; модель отражала конфигурацию полипептндной цепи и местоположение группы гема, содержащей атом железа. Это был первый случай, когда удалось получить, ло существу, фотографию молекулы белка, правда, недостаточно четкую. Как отмечалось выше, при создании всех гипотетических моделей белка предполагалась симметричная укладка основной цепи.
У. Брэгг по этому поводу писал: "Долгое время путеводной звездой, вдохновляющей исследования, оставалась та идея, что молекулы содержат некий род упорядоченной структуры белковых цепей, которая может быть ответственна за строго определенный характер синтеза Паттерсона. Как показали события, звезда эта оказалась ложной" [202. С. 5]. Поэтому наиболее удивительной особенностью построенной Кендрью модели явилось как раз полное отсутствие видимой регулярности и симметрии молекулы миоглобина.
Для получения трехмерной структуры миоглобина с разрешением, которое давало бы возможность увидеть положение каждого отдельного атома, потребовался анализ более 10 000 рефлексов. Такая работа Кендрью и соавт. была закончена в 1960 г., результатом явилась модель белка с разрешением 2,0 А (рис.!.1) [203 — 205]. Найденное на основе строгого рентгеноструктурного анализа пространственное строение белка подтвердило предположение Брэгга, Кендрью и Перутца о наличии в структуре миоглобина локальных спиральных образований цилиндрической формы и предположение Полинга и Кори о том, что эти образования являются а-спиралями. Оказалось, что около 75% аминокислотных остатков составляют восемь правых а-спиралей А, В,..., Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
