Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Трудность в интерпретации функции Паттерсона состоит в необходимости нахождения координат л атомов из лз ее максимумов, многие из которых сливаются из-за частого пересечения межатомных векторов. В результате метод Паттерсона оказался применимым только для монокристаллов простых молекул. Его несостоятельность для расшифровки белковых рентгенограмм была в принципе ясна уже в конце 1930-х годов. Позднее зто подтвердила Кроуфут, построившая плоские и пространственные карты Паттерсона для инсулина, и Перутц, рассчитавший их для гемоглобина.
Паттерсоновские карты белков содержали многие сотни тысяч межатомных векторов, интерпретировать которые и разрешить с их помощью отдельные пики не представлялось возможным. В основе метода проб и ошибок лежат постулированные модели, соответствие которых реальной структуре оценивается с помощью фактора расходимости (В), определяемого экспериментальными (Ря) и теоретическими (Р,) значениями структурных факторов с ~ = г((~ ]- ~~]~ г ~ь])). я.* ~ * ь~, зм лекулам, поскольку вероятность угадать структуру сложной молекулы, тем более белка, ничтожно мала. Метод изоморфного замещения уже в течение тридцати лет является основным, если не единственным, в рентгеноструктурном анализе белков. Его монополия была нарушена лишь в начале 1990-х годов (см. гл. 4).
Метод предложен в 1937 г. Дж. Робертсоном и И. Вудвордом при расшифровке структуры фталоцианинов [173]. Он быстро превратился в общий метод анализа структур малых молекул, поскольку основывался на разумном предположении о том, что при 4! химическом замещении одного атома в молекуле на другой, сходный по электронному строению, например атома серы на селен, брома на йод, пространственная структура молекулы не претерпевает существенных изменений. Изоморфное производное считается совершенным, если ряд электронной плотности замешенной молекулы отличается от ряда исходной молекулы только наличием пика в положении замещения тяжелым атомом.
Естественно, долгое время, пока ни для одного из белков не было известно химическое строение, мысль об использовании этого метода в кристаллографии белков никому нс приходила. Таким образом, все существовавшие методы решения фазовой проблемы были созданы для малых молекул и прямо не подходили для белков.
Даже сейчас возможности этих методов ограничены элементарными ячейками, содержащими не более ста атомов. Не могли быть использованы для глобулярных белков методы рснтгеноструктурного анализа фибриллярных белков. Рентгенограммы последних вследствие неполной упорядоченности и нестрогой регулярности волокон содержат небольшое число рефлексов (5-50), которые к тому же, как правило, диффузны, Они получаются за счет дифракции рентгеновских лучей на регулярных участках волокон. На основе столь бедной рентгенограммы нельзя даже в принципе выполнить полное и независимое определение на атомном уровне структуры фибриллярного белка. Иными словами, число неизвестных (координаты атомов) в этой задаче намного превышает число уравнений, которые могут быть составлены для их определения на основе известных экспериментальных данных (положений и интенсивностей рефлексов).
Волокнистая структура и нерастворимость таких белков делают практически невозможной их кристаллизацию с хорошей трехмерной упорядоченностью. Поэтому с помощью анализа рентгенограмм фибриллярных белков можно преследовать лишь ограниченную цель идентификации типа регулярных структур псптидного скелета и возможного способа его аранжировки.
Сначала создастся ориентировочная модель, причем только регулярной части белка, рассчитывается картина рентгеновской дифракции этой модели, которая затем сопоставляется с наблюдаемой рентгенограммой. Путем изменения модели добиваются наиболее полного совпадения теоретической и экспериментальной дифракционных картин. Но и такая задача далеко не всегда решается однозначно. Поэтому при рентгеноструктурном анализе фибриллярных белков большое значение имеют дополнительные данные о структуре, полученные иным образом, с помощью привлечения спектральных методов, структурных параметров родственных молекул, информации о плотности,механических свойствах и т,д, Расчет дифракционной картины, соответствующей предполагаемому спиральному строению фибриллярного белка, выполняется на основе теории интерференции рентгеновских лучей спиральными структурами, разработанной Кокраном и Криком ~77].
Обзор методов рснзтеноструктурного исследования фибрнллярных белков содержится в работе К. Холмса и Д. Блоу ~! 74). Глобулярные белки в отличие от фибрнллярных могут образовывать великолепные монокристаллы, в которых все молекулы ндентнч- 42 ны и одинаково ориентированы. Об этом свидетельствовали первые же результаты рентгеновского исследования пепсина, инсулина и гемоглобина [175 — 178]. Дифракционные картины от кристаллов перечисленных белков содержат огромное число рефлексов.
Например, рентгенограмма монокристалла миоглобина, изучение которого было начато в 1948 г. Кендрью, насчитывает около 50 000 рефлексов, т.е. несколько десятков рефлексов на один рассеивающий центр — атом [179]. Таким образом, в случае кристаллических глобулярных белков в отличие от волокнистых фибриллярных белков число неизвестных геометрических параметров молекулы значительно уступает числу уравнений, которые могут быть составлены. Следовательно, рентгеноструктурный анализ глобулярных белков в принципе является таким методом исследования пространственного строения, который может быть выполнен на атомном уровне, не требуя какой-либо дополнительной информации. Чтобы получить из рентгенограммы монокристалла трехмерное изображение молекулярной структуры глобулярного белка, необходимо было прежде всего найти путь к резпению фазовой проблемы. Дж.
Бернал в конце !930-х годов предложил два подхода к решению проблемы фаз в рентгеноструктурном анализе белков [180]. Оба они включали функцию Паттерсона и основывались на изменении интенсивностей отраженных рентгеновских лучей, которое обнаруживалось даже при небольших модификациях кристаллов. Первый из них, так называемый метод набухания и усадки, пытался в течение ряда лет использовать Перутц для определения фаз в днфракционной картине гемоглобина [181 †1]. Заметного успеха в решении проблемы добиться нс удалось. Тем не менее а этих работах Перутца были получены интересные данные, касающиеся внутреннего устройства гемоглобина. В частности, результатом наблюдения изменения интенсивностей дифракцнонных рефлексов, происходящего из-за диффузии солей в жидкосп при кристаллизации белка, явилось правильное определение внешнего очертания полипептидной цепи макромолекулы.
Полученное представление подтверждено изучением дифракционных картин кристаллических форм с разной упаковкой молекул. У. Брэггом и М, Перутцсм обнаружено соответствие между рентгеновской дифракцией а-кератина и паттерсоновским синтезом гемоглобина [188, 189]. Пространственная векторная карта свидетельствовала о присутствии а структуре стержней протяженностью не менее 10,0 А, разделенных между собой фрагментами в — 5,0 А. Был сделан вывод о том, что форма этих стержней соответствует структуре полипептидной цепи акератина.
Подобные стержни вскоре были найдены Кендрью а миоглобине [190, 191]. После открытия Полингом радиальной усредненной векторной плотности паттерсоновского синтеза было высказано предположение, что гемоглобин представляет собой ансамбль а-спиралей. Ю. Арндт и Д. Райли измерили интенсивность рентгеновского рассеяния под разными углами у большой серии аморфных белковых образцов, включая гемоглобин и миоглобин, и пришли к выводу, что спираль является важнейшим структурным компонентом большинства из ннх [192]. То, что а-спираль составляет главную часть глобулярных белков, подтверждалось многими другими данными. Так, в дифракционной картине тропомиозина обнаружен интенсивный рефлекс 1,5 А— характерная особенность рассеяния а-спиралн. Согласно спектрам дисперсии оптического вращения.
исследованным Коэном и Сент-Дьердьи, термолизин содержит 70-80% а-спиралей [193]. Исключение, пожалуй, составляла одна рибонуклеаза, которая по данным рентгсноструктурного анализа н дисперсии оптического вращения практически не содержала этой структуры, а также других регулярно свернутых форм. Вопрос о структурной организации молекул глобулярных белков был одним из наиболее дискутируемых в 1950-е годы. Подавляющее большинство исследователей было единодушно в своем положительном отношении к а-спиральной концепции Полинга н Кори.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
