Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Фасман писал: "Общепризнанно, что лишь несколько конформацнй благодаря своей внутренней термодинамической стабильности будут встречаться наиболее часто и, по-видимому, именно они составляют общую основу белковой структуры" 1112. С. 5981. В то же время обнаруженные у гомополипептидов всех природных а-аминокислот многообразие форм и многочисленность влияюших на структуру факторов, а также отсутствие даже в случае простейших полипептидов должного понимания причин реализации у них различных конформаций указывали на то, что вопрос об общности структур искусственных и природных полипептидов не является столь простым, как это представлялось ранее. Предложенная Блоутом конформационная гипотеза разделения аминокислот на спиралеобразующие и спираленеобразующие опиралась на ограниченный экспериментальный материал.

Она не согласовывалась со многими, известными в то время фактами. Популярность этой гипотезы можно объяснить лишь отсутствием альтернатив. Структурные исследования синтетических поли- пептидов не оправдали первоначальной надежды найти простые корреляции между химическим и пространственным строением полипептидов. Полученные экспериментальные данные показали, что таких простых корреляций не существует даже в рамках гомополипептидов. Глава 2 СТАНОВЛЕНИЕ МЕТОДА РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ Изучение пространственного строения глобулярных белков в период, непосредственно следующий за открытием Полингом и Кори а- спиралей и б-структуры (1950-е годы), может показаться на первый взгляд менее впечатляющим по сравнению со структурными исследованиями того же периода синтетических полипептидов.

Однако если в то время исследователи полилептидов уже сказали все или почти все, что они могли сказать полезного о пространственной организации белковых молекул, то у ученых, занимавшихся кристаллографией глобулярных белков, решавших в 1950-е годы свои внутренние проблемы, все еще было впереди. Для того чтобы прийти к результатам, которые потом составят целую эпоху в развитии молекулярной биологии и кристаллографии макромолекул, необходимо было преодолеть целый комплекс методических трудностей, Сейчас очевидно, какая колос- 38 сальная потенция была заключена в рентгеноструктурном анализе белков и как позднее были блестяще реализованы его возможности при решении многих проблем молекулярной биологии.

Тогда же об этом не догадывались не только ученые, стоящие в стороне от данного метода, но и его энтузиасты и даже непосредственные исполнители. Так, один из создателей рентгеноструктурного анализа, основатель крупнейшей школы кристаллографов, где начали изучаться белки, Л. Брэгг, всегда горячо поддерживавший М.

Перутца и Дж. Кендрью, оценивал эту работу в 1947 г., как обладающую "вероятностью успеха, не отличающейся существенно от нуля" (170]. Не представляли всей сложности выбранного ими пути Перутц и Кендрыо, первые определившие структуру белков на атомно-молекулярном уровне. М. Г1ерутц в 1970 г. подчеркивал, что он поначалу и не думал о решении проблемы полной структуры, а Дж.

Кендрью полушутя утверждал, что для него первоначальное невежество в области методики оказалось благом, поскольку оно не позволило ему осознать все трудности. Столь же откровенные и, безусловно, правдивые слова, по-видимому, могли бы сказать многие ученые, добившиеся выдающихся результатов. Часто одна из граней таланта исследователя проявляется не столько в четком представлении всей сложности изучаемого им явления и строгой оценке возникающих при этом трудностей, сколько в своевременности постановки проблемы, умении распределить трудности в определенном порядке и преодолении их не одновременно, а последовательно, зная, конечно, с чего нужно начать.

2.1. ОСОБЕННОСТИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА ГЛОБУЛЯРНЫХБЕЛКОВ Систематическая работа с белками началась вконце 1920-х годов У. Астбери, который был привлечен для решения проблемы пространственного строения шерстяных волокон У. Брэггом. Позднее в содружестве со специалистами по химии шерсти он изучал с помощью рентгеноструктурного анализа фибриллярные белки, начав с кератина (см.

гл. 1). Другой выдающийся ученик школы У. Брэгга, Дж. Бернал, начал в 1934 г. изучение кристаллических глобулярных белков. Он работал с И. Фанкухеном и Д. Кроуфут (Ходжкин). Вскоре к ним присоединились М. Перутц, бывший студент Л. Брэгга, избравший в 1937 г. предметом своей диссертации определение кристаллической структуры гемоглобина, Д. Райли и Дж.

Бойсе-Уотсон. С 1946 г. сначала вместе с М. Перутцем, а потом самостоятельно в этой области начал работать Дж. Кендрью, также ученик Л. Брэгга, а с 1955 г.— Д. Филлипс. Если сюда же присоединить Ф.Крика, ставшего заниматься белками в 1949 г., то получим почти полный список лиц, создавших кристаллографию белка и выполнивших пионерские исследования по расшифровке трехмерных структур белковых молекул.

Путь к этому прошел через решение следующих проблем: 1) получение белковых кристаллов; 2) решение проблем фаз; 3) получение изоморфных 39 тяжелоатомных производных; 4) измерение интенсивностей большого числа отражений; 5) разработка алгоритма и создание компьютерных программ; 6) построение карт электронной плотности и интерпретация результатов. Каждая из проблем включала как чисто научные, так и многочисленные методологические и технические вопросы. Все здесь решалось впервые не только из-за уникальности объекта и его чрезвычайной сложности, но также и потому, что метод рентгеноструктурного анализа не был еще достаточно разработан.

Первая трудность, с которой пришлось столкнуться, заключалась в получении белковых кристаллов нужных размеров и хорошего качества. До работы Бернала и Кроуфут с пепсином не было получено удовлетворительных дифракционных картин ни для одного глобулярного белка ~421. Дело в том, что кристаллы белков необычны в том отношении, что они содержат приблизительно 50% воды (по объему).

При длительной экспозиции образец высыхал и кристалличность белка терялась. Авторы разработали метод получения увлажненных кристаллов. Во избежание гидратацни образец в маточном растворе помещался в капилляр. В первой же работе был получен результат принципиальной важности.

Дж. Бернал и Д. Кроуфут наблюдали четкую дифракционную картину кристаллического пепсина, которая пока еще неясным образом заключала в себе структурные детали белка вплоть до атомного уровня. Наличие на рентгенограмме огромного числа рефлексов могло иметь место только при идентичности пространственной организации всех молекул пепсина, по крайней мере в кристаллическом состоянии белка. Кроме того, удалось установить, что белковые молекулы представляют собой плотноупакованные тела глобулярной формы диаметром 25 — 35 А.

Другая проблема, также связанная с подготовкой кристаллов к съемке, возникла значительно позже, когда в принципе была решена фазовая проблема и встала задача получения кристаллов изоморфных производных. На первых же порах, после получения прекрасных дифракционных снимков глобулярных белков, требовалось решить вопрос об их расшифровке. В чем же заключалась новизна рентгеноструктурного анализа глобулярных белков по сравнению с анализом малых молекул и фибрнллярных белков? Суть рентгеноструктурного анализа любого монокристалла состоит в определении амплитуд всех дифрагированных лучей (отражений) и их фаз. Зная амплитуды и фазы, можно воспроизвести распределение электронной плотности элементарной кристаллической ячейки и, следовательно, найти ее геометрические параметры, а также параметры структуры образующих ее молекул. Амплитуды определяются по интенсивностям рефлексов, но найти фазы путем непосредственных измерений нельзя.

В связи с этим как в кристаллографии малых молекул, так и в кристаллографии белков возникает так называемая фазовая проблема — основная проблема расшифровки любой кристаллографической структуры. В рентгеноструктурном анализе малых молекул для ее решения разработаны прямой метод, метод Паттерсона, метод проб и ошибок, метод изоморфного замещения. Со временем каждый из ннх приобрел целый ряд 40 вариантов (171].

В днфракционной картине, даваемой единичной молекулой (молекулярной трансформанте), расположение пиков и впадин чередуется. Оказалось возможным составить уравнения, связывающие фазы и амплитуды различных структурных факторов. Эти уравнения, когда их не очень много, поддаются аналитическому решению без привлечения интуитивных соображений и субъективных оценок, В результате становятся известными фазы. Такой подход получил название прямого метода, В середине 1930-х годов А. Паттерсон разработал метод, который позволяет частично обходить проблему фаз, причем это делалось тем надежнее, чем проще молекула (172].

Метод основан на получении функции распределения (функции Паттерсона), представляющей собой ряды фурье, в которых коэффициентами или структурными амплитудами ггв служат получаемые опытным путем значения интенсивности отраженных пучков лучей. Поскольку функция Паттерсона является фурье-трансформантой величины Рьм, а не ~н, ее можно рассчитать непосредственно по наблюдаемой дифракционной картине. На атой основе строятся векторные карты, дающие ориентировочное представление о структуре молекулы.

Характеристики

Список файлов книги