Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 104

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 104)

Разность свободной энергии белка дикого типа и мутанта [у свернутого состояния — Ьббн) непременно содержит в неявном виде энергию переориентации боковых цепей, вызванной мутацией. Найти эту энергию экспериментальным путем не представляется возможным, а к теоретическому подходу Фершт и сотр, относятся скептически' [110, 138). Поэтому найденные параметры ср, даже когда онн имеют значения вблизи 0 и 1, несут в себе неопределенность, которая в той или иной мере (в какой— неизвестно, но каждый раз — в разной) обесценивает предпринятые усилия.

Глава [4 СВЕРТЫВАНИЕ БЕЛКОВ В КЛЕТКЕ Рибосомный синтез белка заключается в росте полипептидной цепи путем последовательного присоединения очередной аминокислоты к карбоксильной группе предшествующего остатка. Отдельный цикл элонгации включает три этапа; связывание амнноацил-тРНК, образование пептидной связи и транслокацию рибосомы — перемещение ее вдоль молекулы мРНК в направлении 5' -а 3' от одного кодона к другому.

И так до встречи с одним из трех стоп-кодонов. Рост белковой цепи заканчивается присоединением к стоп-кодону фактора освобождения, останавливающего трансляцию и вызывающего отделение завершенного полипептида от рибосомы. До этого растущий С-конец последовательности все время остается ковалснтно фиксированным в пептидилтрансферазном центре, а Х-конец — свободным. При отсутствии каких-либо регуляторных воздействий на биосинтез белка скорость считьгвания мРНК может достигать у прокариот около 50 нуклеотидов в секунду, а эукариот — около 30 [152[. Следовательно, элонгация белковой цепи небольших размеров продолжается не менее 10 — 30 с. За это время совершается множество конформационных изменений растущего пептида, поскольку единичное изменение — поворот атомной группы вокруг одинарной связи, занимает всего 10-м — 10г и с.

Таким образом, в условиях )п у)ио, в отличие от спонтанной ренатурацни развернутой цепи в опытах )п уйго, процессы химической н Вопрос о том, насколько такое отношение оправдано, рассматривается в следувощем эмме этого и гдания. 40о пространсгвенной структурной органиэапии белковой молекулы могут идти параллельно и заканчиваться практически одновременно.

В этом случае нельзя исключить котрансляционное свертывание полипептидной цепи в нативную трехмерную структуру и обретение белком, еще прикрепленном к рибосоме, биологической активности. Предположение о возможной укладке белковой цепи в нативную конформацию во время ее синтеза 'ш ч)чо напзло подтверждение в большом числе экспериментальных исследований, Классическим примером является р-галактозидаза, гидролизующая лактозу до глюкозы и галактозы. Для проявления своей активности фермент требует не только определенной структурной организации отдельной макромолекулы, но и формирования из четырех субъединиц специфического четвертичного комплекса 1152).

Тем не менее, было обнаружено, что растущая, т.е. еще связанная с рибосомой, полипептзздная цепь ферментов способна взаимодействовать с находящимися в растворе свободными субъединицами и образовывать четвертичную структуру, обладающую 0-галактозидазной активностью. До завершения трансляции мРНК и освобождения от рибосомы полипептндная цепь этого же фермента также реагирует на антитела третичной структуры, т.е. обнаруживает нммунологическую специфичность зрелого белка [153). Свертывание белка по ходу его рпбосомного синтеза, направленного от Х-конца молекулы к ее С-концу, происходит при переменной длине цепи и меняющихся внешних условиях.

В начале процесса, когда длина растущего полипептида не достигает 30 — 40 аминокислотных остатков, синтезированный участок находится внутри рибосомы и не контактирует с внешней средой; его конформационное состояние определяется аминокислотной последовательностью и рибосомным окружением. После того, как длина нарождающейся белковой цепи превысит 30 — 40 остатков, свободная Х-концевая часть полипептида оказывается за пределами "родительсКого дома" и на ее свертывание начинает воздействовать новый внешний фактор — среда, окружающая рибосому.

Следовательно, прн биосинтезе и одновременной сборке нативиой конформации белка каждый участок аминокислотной последовательности, удаляясь от пецтидилтрансферазного центра, проходит как бы две стадии обработки — первичную (в рибосоме), очевидно, препятствующую образованию непродуктивных контактов между остатками растущего полипептида, и вторичную (вне рибосомы), необходимую для сборки нативной конформации. Коль скоро свертывание белковой цепи (п и!го в рибосомах не нуждается, но в то же время чувствительно к природе растворителя, величинам рН, ионной силы и т.д., есть основания полагать, что внутририбосомная обработка является вспомогательной операцией, не определяющей свертывание цепи, а лишь облегающей и ускорякзщсй его.

Главную же роль в организации физиологически активной пространственной структуры белка играют внерибосомные внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия. Окружающая среда, в которой оказываются белки во время н сразу после окончания трансляции, зависит от локализации ведущих 407 белковый синтез рибосом, организованных в полирибосомы. Одна часть рибосом находится в свободном состоянии, другая — прикреплена к мембранам эндоплазматического ретикулума. Свободные рибосомы размещены в цитозоле, не занятом органеллами пространстве, и в матриксе митохондрий или, в случае растений и хлоропластов— концентрированном растворе различных ферментов. Котрансляционное и посттрансляционное свертывание белковой цепи в этих компартментах происходит в водной среде. Здесь синтезируются белки главным образом для внутренних нужд, а поэтому эмбриональные, недифференцированные и быстро растущие и размножающиеся клетки содержат преимущественно свободные рибосомы.

Связанные рибосомы расположены на обращенной к цитоплазме стороне одиночной мембраны шероховатого, эндоплазматического ретикулума и также одиночной наружной мембраны ядерной оболочки. В этом случае внерибосомное свертывание полипептидной цепи осуществляется в условиях преимущественно гидрофобного окружения фосфолипидного слоя мембраны. Рибосомы, ассоциированные с эндоплазматическим ретикулумом и ядерной оболочкой, синтезируют белки для мембран, других органелл и секреторные белки, выделяемые через мембранные просветы на поверхность эпителия или во внутреннюю среду организма. Таким образом, сборка трехмерных структур белковых молекул и образование гомо- и гетерогенных олигомерных белковых комплексов происходят в разных условиях в зависимости от локализации и состояния рибосом, клеточных компартментов, в которых осуществляется рибосомный синтез, и типа клетки. Очевидно, они не совсем одинаковы у прокариот и эукариот.

В еще большей мере условия !и ювао могут отличаться от условий ренатурации развернутой белковой цепи 1и л1го. Между тем, свертывание полипептида в процессе бносинтеза и в искусственных условиях во многих случаях приводит к идентичным пространственным структурам. Классические исследования, свидетельствующие о возможности восстановления физиологически активной конформации белковой молекулы, были проведены еще в первые десятилетия ХХ в. Л.

Михаэлисом, М. Ансоном, А. Мирским, Г. Нейратом, Ф. Гауровицем, Л. Г!олингом и др. 1154!. В !945 г. Ансон постулировал обратимость реакции денатурации — ренатурации белков [155!. Бесспорные экспериментальные данные о полной реставрации активной трехмерной структуры белка после его денатурации, т.е. разрушения всех элементов нативной конформации и разрыва дисульфидных связей, получены в 1961 г. К. Анфинсеном и сотрудниками прн изучении рибонуклеазы А. Было доказано, что развернугая полипептидная цепь фермента с восстановленными сульфгидрильными группами остатков Сух вновь самопроизвольно свертывается после удаления денатурирующего агента, принимая конформацию, неотличимую от чисто природного объекта в отношении системы дисульфидных связей и каталитической активности.

Такой же результат Анфинсен и соавт. !156, 157) позднее получили при изучении обратимой денатурации 408 стафилококковой нуклеазы и миоглобина. Во всех случаях белки полностью ренатурировали свои пространственные формы в пробирке и, следовательно, процесс определялся исключительно аминокислотными последовательностями. К. Аифинсеном была сформулирована так называемая термодинамическая гипотеза, согласно которой процесс структурной самоорганизации белковой молекулы подчиняется свободной энергии Гиббса, а поэтому нативная конформации белка обладает минимальной энергией, т.е. является глобальной [2[.

Отсюда следовал фундаментальный вывод о том, что вся информация, необходимая для сборки окончательной структуры белка, заключена в его аминокислотной последовательности. Иными словами, вновь синтезируемый полипептид обретает свою физиологически активную конформацию во внутриклеточном окружении без помощи других молекул и без затраты энергии, т.е спонтанно. К аналогичным заключениям вскоре пришли М.

Характеристики

Список файлов книги