Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 102
Текст из файла (страница 102)
[110, 137!. Рассмотрим насколько оно справедливо в самых благоприятных случаях, т.е. при заменах, названных Ферштом "ненарушающими делециями" и отнесенных к идеальным мутациям. Результаты экспериментального исследования стабильности соответствующих мутантов представлены в табл.
!П.2. При соблюдении правила аддитивности одинаковые мутации должны приводить к одним и тем же или достаточно близким величинам изменений свободной энергии развертывания цепи, а величина Ь21ОО в случае Пе е А1а должна приблизительно равняться сумме изменений энергии ЬЬСзп, вызванных заменами Пе на Ча! и Ча! на А!а, В действительности, опытные значения ЬЬ1ло попадают в перекрывающиеся 397 0,9 0,3 3,0 8 12 54 та саина ш.з широкнс интервалы 0,3 — 1,8ккал/ и ея яяаевовоинонзнергяи моль (1!е — г Ча(), 1,! — 4.7 ккал/ развертыванияподдевегвяеммочевянм моль (1!е -+ А)а) и 1.3 — 3.4 ккал/ волковойнепиаарназмпрпзамеиеоегаткоа моль (Ча! -3 А1а), отличаясь в Аар я иег на А!а каждом из них приблизительно н шесть, четыре и три раза.
В табл. П1.3 сопоставлены величины /!ЬОп, полученные при заменах остатков Азр и Бег барназы, способных образовывать эффек- 91 1,9 тинные электростатические кон- 92 2,8 такты и водородные связи, на остаток А!а, лишенный таких возможностей. Полученные Ферштом н соавт. [137! результаты мутаций столь различны, что вряд ли по ннм можно сказать что-либо определенное о роли боковых цепей аспарагиновой кислоты и серина в стабилизации трехмерной структуры белка. В табл. Ш.4 приведены величины изменений свободной энергия денатурацни мутантов, полученных заменой одного остатка натнвного белка на существенно отличающиеся по химическому и пространственному строению остатки (ТЬг -з Х, Туг о Х) или заменой различных по своей природе остатков на глицил (Х -3 О!у).
Данные этой таблицы, в отличие от предыдущей, скорее удивляют близостью значений /з/зОп у мутантов, имеющих столь разные остатки. Например, замены в последовательности барназы Т)гг-16 на Аг8 и (.уз-27 на О!у изменяют свободную энергию Гиббса всего на — 0,5 н 0,4 ккал/моль, в то время как при заменах ТЪг-6 на А1а и О!п-29 на О1у изменения составляют 2,1 и 1,8 ккал/моль. Следовательно, и здесь энергия межостаточных невалентных взаимодействий нс может быть предаггавлена аддитивной суммой неизменяющихся парциальных вкладов. Такой же вывод с неизбежностью следует из данных, приведенных в табл. Ш.5, где сопоставлены величины изменений свободной энергии развертывания белковой цепи, имеющей единичные, двойные и тройную циклические мутации.
Легко видеть, что величины Ь33О0 последовательности с заменами двух нли трех остатков не являются суммой /з/зОо двух или трех последовательностей с единичными заменами в тех же местах н на тс же остатки, т.е. /1ЬОп(А1а — А1а) = = Ь/зОп(Х,— >А!а) + ЛЬСзр(Х1-зА!а), а ЬЛОр(А!а-А1а-А1а) = 2!ЛОо(Х,-зА!а) + АЬОр(Х,— >А!а) + ЬЬОо(Ха — гА!а).
При соблюдении аддитивности величина /зЬОп мутанта (А1а-8 — А1а-10) была бы равна около 4,3 ккал/моль, тогда как в действительности она составляет всего 0,4 ккал/моль, а величина ЬЬО0 мутанта (А1а-8-А!а-12 — А1а-! 10) должна была бы быть около 1,6 ккал/моль, а она равна — О,! ккал/моль. Таким образом, имеющиеся экспериментальные данные о различиях в свободной энергии натнвной барназы и сс мутантов про- 398 "1' а 6 л и д а П1.4 Измеяеивя аюбедной знергяв развертыаання иод дейсгаяем мочеаявы белковой ясна баряазы ири замене векоюрых амвяоквслотяых остатков 13 А!а 3,3 17 А!а 2,0 24 Ряс 0 78 Рве 1,3 103 Рас О 6 01у 12 6 Т!и 6 А1а 2,1 26 Т1к 16 Я с! 1,7 27 1.уз 16 Агб -0,5 29 О!а 26 6!у 1,5 26 А!а 1,9 99 Ча! 2,7 105 Ча1 2,2 1,2 1,5 0,4 1,8 Т а б л н д а П1.5 Измеяеяия свободвой звертив развертытавни иод действием мочеаины белковой нева барназы иря сдави чвей, двойяей н тройной замеяах амяяекиаютяам есютков -0,1 0,9 А1а-8 — А!а-Ю 0,4 А!а-8-А!а-12— А1а-110 3,4 А1а-8-А!а-12 0,8 0,3 А!т-12-А1а-110 -0,4 0,4 Аю-тА1а-В Ча! — тА!а-10 А ар-тА!а- Рз Аг тЛ1а.1!0 тиворечат, причем существенно, одному из основных положений метода Фершта о постоянстве вкладов отдельных атомных групп боковых цепей аминокислотных остатков в стабилизацию структуры белка.
Отсутствует соответствие даже при тех минимальных изменениях в последовательности, которые автором отнесены к идеальным 11101- Оказалось, что "ненарушающие делеции" Фершта, т.е. переход от объемных алифатнческих боковых цепей к менее обьемным той же природы, не соответствуют своему названию. Аминокислотные замены, подобные 1!е и А!а или даже Ча1, сопровождаются устранением целого ряда невалентных контактов и нарушением существовавшей в локальной области нативной структуры согласованности межостаточных взаимодействий, что, в свою очередь, ведет к повышению энергии поверхностного слоя вокруг образовавшейся "пустоты", самопроизвольной переориентации ближайших боковых цепей, отвечающей изменившимся условиям, и установлению новых невалснтных взаимодействий.
Поскольку окружение каждого остатка в 399 трехмерной структуре белка в химическом и пространственном отношении уникально, а также учитывая взаимодействия с молекулами растворителя, то неповторимы и энергетические последствия любых аминокислотных замен. Следовательно, лежащее в основе разработанного Ферштом подхода предположение об отсутствии или незначительности кооперативного эффекта при "ненарушающих делециях", как и других аминокислотных заменах, противоречит собственным экспериментальным данным, касающимся стабильности барназы и многих десятков ее мутантов.
Сделанные на этой основе эмпирические оценки энергетическим вкладам отдельных атомных групп белковых цепей в стабильность структуры белка вряд ли можно считать обоснованными. Перейдем теперь к рассмотрению результатов исследования Фершта и соавт, [138, 139) кинетики свертывания и развертывания барназы и ее мутантов. Ранее, при изучении денатурации барназы был сделан вывод, что по ходу своего развертывания белковая цепь сначала преодолевает переходное состояние, определяющее скорость процесса при всех концентрациях денатуранта (мочевины), а затем последовательно принимает ряд промежуточных форм, из которых идентифицировать удается лишь одну (1) )131!.
Поэтому минимальная кинетическая схема, согласующаяся с существующими опытными данными, имеет вид: 0 ~Ф 1~~ ТЯ Ф~ Ы Переходное состояние между 1 и Х, не наблюдаемое экспериментом, авторы представляют флуктуирующим образованием, однако, сохраняющим, некоторые черты исходной нативной структуры (рис. П1.21) !130, 137), Для анализа подобного состоянии существует только один подход — кинетический, который и был использован прн изучении процесса в направлении развертывания цепи. Такой выбор имеет то преимущество, что в этом случае процесс начинается с хорошо известной пространственной структуры белка. Константа скорости развертывания (йп) зависит от концентрации мочевины и, согласно К.
Тэнфорду, определяется по формуле: н,о 1п)го = !п1~р + шко ' !!НзХ)зСО! нго где кр — константа скорости денатурации в воде, а юков эмпирический параметр, характеризующий увеличение экспонированной растворителю поверхности белковой цепи при переходе от полностью свернутой формы к переходному состоянию 1! 5 Ц. Действие мутации на энергию переходного состояния относительно свернутой формы, т.е. энергию активации, ЬОтз н (рис. Ш.21), рассчитывается по уравнению Аррениуса, а изменение ЬОтз н мутанта по сравнению с ЬОтз ю белка дикого типа, т.е.
ЬЬОтз ю находится из соотношения ЬЬОто я — -КТ!п()со!)сп), детально рассмотрены термодинамические и кинетические данные о денатурацни барназы н десятков ее мутантов (в основном единичных), На этой основе были рассчитаны параметры утз для переходного состояния и сделаны заключения о структурных изменениях белковой цепи барназы, происшедшие при ее развертывании на участке Х ~Ф 'ГЯ Они рассматриваются нами после короткого обсуждения аналогичного материала, полученного для промежуточного состояния (1) на стадмн свертывания цепи Р ~~ 1 ! 139). Изменения свободной энергии состояния 1 при мутации рассчитывались из констант скорости развертывания (1с ) и свертывания ()г О): дда,, =-Втъкй„"")й ' )/(к ОКО' ) Нзо Н20 ,Н20 ,Н20 где и -, яр и йр ' й~ ' — константы скорости развертывания и свертывания белковой цепи соответственно дикого типа и мутанта в воде.
Анализ действия мутантов на промежуточнос состоян'ие опирается на параметр рь значения которого прн свертывании цепи рассчитываются по формуле Ф1 = 1 — (ДДО~ и УДДОО и). В табл. И!.6 приведены итоговые результаты всей работы Ферщта и сотрудников, посвященной изучению пути свертывания белка с привлечением большого числа мутантов (1!О, 113, 137 — 141). Исключены лишь данные о нескольких параллельных мутациях, не содержащих существенной дополнительной информации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
