Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Значения д для денатурацни и ренатурации связаны между собой простой зависимосгью: !рн =1 — Чо Интерпретация значений параметра ф более сложна, чем интерпретация !3, из-за нелинейной зависимости свободной энергии рассматриваемых состояний свертываемых белковых цепей. Имеются лишь две ситуации; !у = 0 и !р = 1, при которых параметр д трактуется однозначно и совпадает с коэффициентом Бренстеда. Значение ~рн — — 0 (случай ренатурации) показывает, что структура аминокислотной последовательности в месте мутации нативного белка н его аналога находится в полностью развернутом состоянии, а фи = 1 — полностью свернутом (при денатурации наоборот).
Промежуточныс значения ф свидетельствуют о частичном свертывании или частичном развертывании белковой целя. Для оценки вклада в термодинамику и кинетику процесса невалентных взаимодействий между двумя конкретными боковыми цепями (Х и У) Фсрштом и соавт. (134 — 136) предложен метод так называемого двойного мутантного цикла. Он требует исследования, наряду с нативным белком Š— ХУ, трех его мутантов Š— Х, Š— У и Е, образующих циклическую систему, представленную на рис. Ш.16. При соблюдении требований, сформулированных для мутантов с одиночными заменами, двойной мутантный цикл позволит определить свободную энергию парных взаимодействий боковых цепей, используя соотношение ДДОхт = ДОв-хт — (ДОв-х + ДОв-т) + ДОв.
Переходя от ДДОх» к параметру ф, можно по значению последнего выяснить влияние иевалевтных взаимодействий Х с У на ход процесса, Разработанный Ферштом и соавт. [137 — 141] подход к изучению термодинамнческнх и кинетических аспектов свертывания белковой 39! цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил впервые в научной практике последовательно проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка [барназы), не содержащего дисульфидных связей. Рассмотрение цикла работ о барназе предварим кратким описанием принципиальной схемы такого рода исследований.
1. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания белковой цепи. 2. Модификация потенциально важных для денатурации межостаточных взаимодействий путем соответствующих изменений боковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Составление оптимального набора мутантов н их синтез методами генетической инженерии. 3. Термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурацин [денатурации) нативного белка и мутантов; определение констант равновесия и скорости процессов; расчет изменений свободной энергии стабильных структур, промежуточных и переходных состояний; построение энергетических профилей путем свертывания белковых цепей дикого н мутантного типов. 4, Построение разностных энергетических диаграмм, показывающих различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания нативного белка и мутантов.
Реализация процедуры приводит к выяснению эмпирических зависимостей между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации. Каждая мутация, которая в рассматриваемом методе отличается от дикого типа одной атомной группой у одного аминокислотного остатка, позволяет количественно оценить ее парцнальное воздействие на скорость свертывания исгабильность трехмерной структуры. 13.2. РЕНАТУРАЦИЯ БАРНАЗЫ Первым и пока что единственным белком, денатурация которого изучена методом Фершта, является барназа — внеклеточная рибонуклеаза из ВасШпз ашу!о1н[пеГас[епз. Ее аминокислотная последовательность включает 110 остатков. Пространственное строение белковой молекулы в кристалле изучено методом рентгеносгруктурного анализа с разрешением 1,9 А [142, 143], а в растворе — с помощью ЯМР-спектроскопии [144).
Барназа обратимо денатурирует при изменении температуры, введении додецилсульфата натрия, мочевины и гуанидингидрохлорида [145, 14б). Прн равновесных состояниях свертывание и развертывание цепи соответствует двухфазному процессу [)3 ~~ Х), изменение свободной энергия по ходу которого было измерено с удовлетворительной точностью [147 — 149). Белковая цепь 392 Таблица Ш.! элеыевты втори мой структуры я винрофобиые яуклеоция иктивяой кояфорывцин 61ангихы 1 — 5 !Ч-Конец и!-Спираль Рве-7, Чв1-10, А!в-11, !лп-14 глп-20, Туг-24 6 — 18 агаегла агСпирвль а -и пз-Спираль Ог-Нхгвб 0 РСтруктура ах-Петля Пе-25 А!е-30, 1.еп-33 Тгр-35 1.еп-42, Ча1-45 19 — 27 26 — 34 30 — 40 41 — 46 47 — 49 50 — 55 56 — 69 11е-51 Рве-56, Сея-.Я А! а-74, 1!е-76 Тгр-71 Туг-78 Да-бб, Туг-90 Туг-97 Туг-103 Рве-106 Туг-94, 1!е-96 1!е-109 Прнвгкввве Попверкпуты оетвтки, боковые цепи кыорых ивхохятсв в певтре вуклевпии.
рз и 84. Вторая нуклеация Хпс!2 объединяет боковые цепи восьми гидрофобных остатков спиралей 02 и аз, складчатого листа 81 н петель 1) 1, 02 и Й4 и, следовательно, стабилизирует среднюю часть аминокислотной последовательности барназы (табл. И1.1; рис. ВЬ19). Если в Хпс!, дисперсионные взаимодействия боковых цепей имеют преимущественно радиальную направленность с центром 11е-88, то в Хпс12 они образуют потенциальную поверхность сложной пространственной фигуры.
В нуклеацин Хпс!3 (рис. 1П.20) ассоциированы боковые цепи семи остатков !3-структур 92-85) и й-петель (Пз и йб). Центрами взаимодействий являются расположенные друг против друга боковые цепи Ьеп-63 и Ьеп-89. При попытке в общем виде отразить последствия гидрофобного аффекта на свертывание белковой цепи барназы можно сказать, что он приводит к образованию трехмерной структуры молекулы, имеющей в отношении своего главного стабилизирующего 394 ОРСтРуктуРа дт-Структура 02 Р1лптб бх-Структура а -и ОРСтРуктУРа С-Конец 70 — 76 77 — 84 85 — 91 92 — 94 94 — 99 100 — 104 105 †1 109 †1 Р н с, !И,! 8.
Гццрофобнаи нуклеациа Мнс[1 трекмерной структуры барназы [1471 гиб и 4 Снир Р и с. !П.19. Гицрофобная нуклеа- ция Мне[2 трехмерной структуры барназы 11471 на э Пахни 2 мз фактора — диспсрсионных взаимодействий — вид своеобразного сэндвича. В его центральном слое расположена [з-структурная система (Д1-[31), частично экранированная от контактов с водой с одной стороны а1-спиралью (Хцс!!), с другой — неупорядоченными участками (); и Йзпетель ([х[нс17), а сбоку — аз-спиралью и [)1-, 04-петлями ([х[цс12). Анализ трехмерной структуры барназы, который в оригинальном изложении Фергпта н соавт. [137, 147) содержит ряд деталей, опущенных здесь, позволил приступить к рассмотрению следующей задачи 39б Петля б Р н е Ш.20. Гндрофобная нукяеа- цня Хне12 трехмерной еуруктуры барнааы !147! — выбору сайт-направленных единичных и мультиплетных циклических аминокислотных замен и составлению, таким образом, набора петя мутантов, подлежащих биосинтезу и термодинамическому и кинетическому изучению, которое, по мнению авторов, должно привести к определению стабильности нативной конформации белка и установлению механизма ее образования.
Отобранная совокупность объектов дальнейшего исследования составила 64 мутанта, из которых 59 отличались от дикого типа барназы одним остатком, четыре — двумя и один — тремя. Замещение произведено не только в местах скопления гидрофобных остатков (!У!пс11 з), но и во всех других областях трехмерной структуры. Далеко не всегда это были замены остатков с более объемными алифатическими боковыми цепями на менее объемные, типа Ие на Ча( или Ча! на А!а. Часто мутировались остатки, несущие положительные (Агя, Ьуа) и отрицательные (Азр, 0!н) целочисленные заряды, соответственно на Иу, А1а и А1а, Иу, Азп, а также остатки с гидроксильными группами (Т[зг, Бег, Туг) на Иу, А!а, Ча!, Агя, Р!1е. Почти во всех экспериментах денатурация белковой цепи проводилась под действием мочевины.
Многие исследования показали, что свободная энергия развертывания в этом случае изменяется пропорционально концентрации денатуранта [(Н2Х)2СО) и может быть определена по формуле: 2!Оо=йО ' — ш. ИН2Х)за) где Або — свободная энергия развертывания в водном растворе, в н,о котором отсутствует мочевина, а т — эмпирический параметр, пропорциональный увеличению экспонированной растворителю поверхности белковой цепи при денатурации [151].Изменение стабильности структуры барназы есть разность между свободной энергией белка дикого типа и энергией соответствующего искусственного аналога Напомним, что идея исследования стабильности пространственной структуры барназы заключалась в предположении, что при минимальном сокращении боковой цепи того или иного остатка происшедшее вследствие этого увеличение свободной энергии (Л2!Оп) обусловлено потерей стабилизирующего вклада невалентных взаимодействий именно той атомной группы, которая исчезла в мутанте.
А. Фершт, излагая основы своего метода, в частности, пишет: 396 Табляяа Ш,2 Изменении еаободноа энергии развертызаини вод девстааем мочеенвы белкееев вена баряазы ири уменыненяи объема алвфатвчеахвх бокоеых яевеб 4 25 51 55 76 88 96 109 4 25 51 55 76 88 96 109 0,6 1,1 1,8 0,3 0,8 1,3 0,9 0,8 1,3 3,5 4,7 1,1 1,9 4,0 3,2 2,1 !О 36 45 3,4 1,3 1,7 "К идеальным относятся мутации, которые исключают небольшие части боковых цепей, образующие простые и определенные взаимодействия, и при этом не вызывают каких-либо других изменений в структуре, кроме отсутствия взаимодействий, связанных с удаленной частью. Мы назвали такие мутации "ненарушающнми делециями" (11О, С.
6!. Наблюдаемые факты могут получить в методе Фершта однозначные трактовки при непременном соблюдении условия, что все замены в 64 отобранных мутантах соответствуют "ненарушающим делециям", т.е. являются идеальными. Только в этом случае изменения свободной энергии искусственных аналогов по отношению к энергии естественного белка будут подчиняться правилу аддитивности и, следовательно, отвечать представлению общей энергии в виде суммы парциальных энергетических вкладов атомных групп, значения которых не зависят от места мутации и природы боковой цепи.
Ситуация здесь в принципе аналогична той, которая в свое время сложилась при попытке представить молекулярную рефракцию как аддитивную сумму рефракций отдельных атомных групп. Эксперимент подтвердил реальность такого представления, Предположение о возможности аддитивного представления энергии обратимой денатурации белка впервые сделано, правда, в неявной форме, в работах Фершта и соавт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
