Попов, Демин, Шибанова - Проблема белка. т.2. Пространственное строение белка (947295), страница 100
Текст из файла (страница 100)
[130-132] предприняли попытку использовать метод в исследовании обратимой денатурации белков, причем сразу в двух аспектах. Во-первых, в создании принципиально нового метода изучения механизма свертывания белковой цепи на уровне отдельных аминокислотных остатков. Сайт-специфические мутантные белки служат здесь инструментами — зондами, позволяющими получать тонкую структурную информацию о процессе самоорганизации белка, недосгупную другими экспериментальными методами. Во-вторых, в разработке новой стратегии исследования ренатурации белков с помощью обычно использусмых методов: ЯМР- и КД- спектроскопии, остановленной струи.
изотопного обмена и т.д. Существенное изменение ситуации обусловлено появлением у каждого метода вместо одного объекта исследования многочисленной ~руины его целенаправленно модифицированных аналогов. Расширение материальной базы открыло перспективу для повышения интерпретационных возможностей экспериментальных методов, особенно при их комплексном использовании. Реализация возросших возможностей потребовала совершенствования методологических подходов. Схематическое представление пути свертывания белковой цепи и некоторые из существующих методов его исследования показаны на рис, Ш.!4, заимствованном с неболыпими изменениями и дополнениями из работы Фершта ]110].
Теоретической основой изучения механизма обратимой дснатурацни белков Ферпп' считает равновесную ~ср38б Статистический клубок т 1о Импульсная спвктроскопия Релаксационнмв матоды Раннив промвжуточныв состояния термодинамические исследования Кинетичвские ЯМР, КД исследовании Поздние промежуточные состояния ИГО-обмен,методы Рентгеноструктурный анализ стопчрлоу н быстрого туаеиия Нвтивная структура белка Р н с. Ш. Пп Мстоды исследования пути свертывания бсп козой цепи )Г Ю) модинамику и формальную кинетику.
Г!оследняя, он полагает, особенно необходима в анализе переходных состояний и короткоживущих промежуточных продуктов. Кинетическая шкала процесса разделена на два режима /меньше н больше одной миллисекунды), отвечающих ранним, обычно более быстрым, н поздним, более медленным, стадиям ренатурации. Соответствующее деление имеет место и между методами исследования.
Например, релаксационные методы, такие, как методы теплового удара н резкого повышения давления, фиксирующие конформацнонные изменения, происходящие за 1 — 100 мкс, используются при изучении денатурированного состояния белковой цепи и начального агапа ее ренатурацин.Методы Н/О и Н/Т обменов 1амндного протона), остановленной струи и быстрого тушения флуоресценцин, напротив, — при изучении завершенной структуры белка и непосредственно предшествующих ее образованию промежуточных продуктов.
Некоторые методы ГЯМР, КД, иммунологический) мокнут быть использованы для изучения конформационных состояний на всех стадиях свертывания. К ннм относится н подход сайт-направленного 13 ° зя7 мутагенеза, имеющий, как отмечалось, два назначения; получение качественно новой информации о пути свертывания белковой цепи и как неиссякаемый источник мугавтных белков. Для раскрытия пути ренатурации и побудительных мотивов процесса требуется прежде всего идентифицировать промежуточные состояния белковой цепи (1), посредством когорых реализуется реакция перехода развернутого состояния (Р) в свернутое (М).
Согласно общепринятой трактовке явления данатурации как равновесного, обратимого процесса, состояния ! находятся на кривой изменения свободной энергии вдоль координаты реакции в энергетических минимумах, разделенных потенциальными барьерами, отвечающими переходным состояниям (ТБ). Как правило, промежуточные соединения 1 термодинамически неустойчивы. Они могут быть обнаружены лишь кинетически, причем в том случае, если их образование предшествует скорость-лимитирующей стадии, а свободная энергия совпадает или ниже энергии состояния Р. Рис. 1!!.15 иллюстрирует три возможных варианта протекания простейшей реакции свертывания Т5 Т~ — — 1 медленно при нестабильном промежуточном состоянии !.
Переменной во всех случаях является энергия состояния Р, а неизменными — ото о носительная энергия состояний 1, ТЯз и )ч. При условии ЬО1 > ЬОо (рис. 1П.15,а) увеличение стабильности 1 ведет к уменьшению потенциального барьера н, следовательно, к увеличению стабильности и о М. Это продолжается пока ЬО1 не станет равной ЬОо (рис. П1.15,6).
При ЬО, с ЬО о (рис. 111.15,в) скорость свертывания и стабильность Х не увеличивается; промежуточное состояние 1 в таком случае становится доминирующей формой нссвернутого белка в условиях денатурации. В методе Фершта денатурация и реиатурация белковых цепей дикого и мутантного типов описываются, как это принято, с помощью экспериментально измеряемых констант равновесия (К) и скорости (к), Предполагая оба процесса равновесными и, следовательно, термодинамически обратимыми, что также является общепринятым, определяют изменения свободной энергии при известных величинах К и 'к соответственно го уравнению изотермы Вант-Гоффа бО = -КТ)пк н уравнению Аррениуса К вЂ” Ае-ьо'Ят где К вЂ” газовая постоянная, Т вЂ” абсолютная температура, А — предэкспоненциальный множитель уравнения Аррениуса, ЬΠ— разница свободной энергии основных состояний, ЬО* — разница свободной энергии переходного и основного состояний(энергия активации).
По рассчитанным изменениям свободной энергии вдоль координаты зях т~ Р и с. 1!1,15. Диаграммы, нллюстзу рирующис влияние соотношения свободной знергин состояний и и ! на скоросп, свертывания белковой цепи и стабильность состояния!а с — аОП <аО1; à — ЕС = ап1; а— до о а о! 1] 321 Р и с. Ш,16.
Профили изменений свободной энергии белков дикого и мутантного типов вдоль координаты ренатурации беяковой цепи )1101 Лганглллг 4уагггйлтлгт реакции находятся различия в энергетических уровнях дикого и мутантного белков и строится разностная диаграмма, представленная на рис. Ш.1б. Центральная идея метода Фершта заключена, однако, не в описанной, достаточно рутинной, котя и необходимой процедуре, а в выборе мутантов, Чтобы дать полезную информацию о стабильности и пути свертывания белковой цени, они должны удовлетворять следующим требованиям: 1) при свертывании не отклоняться от пути ренатурации интактной аминокислотной последовательности; 2) в свернутом состоянии иметь пространственную структуру, существенно не отличающуюся от трехмерной структуры нативного белка; 3) в развернутом состоянии иметь структуру, не отличающуюся от состояния статистического клубка нативного белка; 4) на всем пути свертывания мутантные аминокислотные остатки не должны образовывать невалентных контактов с новыми партнерами 1! 13).
Перечисленным условиям, по Фершту, будут удовлетворять мутантные последовательности с единичными заменами аминокислотных остатков на более простые, обладающие менее объемными боковыми цепями. Иными словами, предполагается, что изменения в стабильности тех или иных состояний и скорости свертывания нативного белка и мутанта, отличающихся одним остатком, обусловлены влиянием той атомной группы, которая отсутствует у искусственного аналога. В этом случае прн замене, например, Пе и Ча! оценивается вклад группы СаНз изолейцина интактной последовательности в значения термодннамических н кинетических параметров процесса ее ренатурации, при замене Пе на А!а — групп СтНз СтНз и СаНз„1!е па Иу — всей боковой цепи изолейцина, а прн замене Бег на А1а нли Туг на Рпе — вклады гндрокснльных групп. Такой подход основывается на предположении об аддитивности невалеитиых взаимодействий боковых цепей, которое, при прочих равных условиях, будет тем более справедливо, чем меньше различий между соответствующими остатками дикого и мутаитного типов.
Привлечение к проблеме свертывания белка сайт-направленного мутагенеза и использование уравнений равновесной термодинамики и формальной кинетики позволили Фершту и соавт. предпринять попытку решить две задачи. Первая из них основывалась на опытных значениях констант равновесия и заключалась в определении вызванных мутациями изменений в стабильности основных состояний белковой цепи.
Ее цель состояла в установлении эмпирических соотношений между глобальной свободной энергией и энергией невалентных взаимодействий боковых цепей в различных областях белковой глобулы [1331. Вторая задача исходила из результатов кинетических измерений процессов свертывания и развертывания нативного белка и мутантов и имела цель обнаружить изменения энергии промежуточных состояний и энергии активации (рис. 1П.16). Различия в энергетических уровнях промежуточных (ЬЬО,) и переходных (ЬЬП*) состояний помогали определить их положения на пути структурной самоорганизации белковой цепи. При этом каждая аминакислотная замена служила своеобразной репортерской меткой наблюдаемого изменения, происходящего на мутированном участке по ходу ренатурацни или денатурации.
Для количественной характеристики структурных изменений в процессах свертывания и развертывания белковой цепи дикого и мутантного типов Фершт и соавт. 1113, 1301 ввели специальный параметр <р, близкий ло смысловому значению параметру !3 в уравнении Бренстеда, связывающем константы равновесия (К) и скорости (!г) реакции серии родственных по химическому строению соединений 1п1с = соим + (3!пК, где 1) — коэффициент Бренстеда, являющийся мерой подобия структуры переходного состояния структуре исходной молекулы.
Прн сохранении в переходном состоянии расщепляемой связи !1 = О, а при ее разрывае р = 1. Эквивалентной формой уравнения Бренстеда является соотношение йб* — сопз! + !1ЬСз,„, где ДО* — энергия активации, ДО, — свободная энергия равновесного состояния. По отношению к двум родственным соединениям уравнение Бренстеда может бвггь записано в увзииценной форме ДДО" ДДО, ' А. Фершт и сотрудники предположили, что зависимость между константами равновесия и константами скорости реакции свертывания натнвного белка и белка, мутированного описанным выше способом, сходна уравнению Бренстеда, и поэтому ввелн аналогичный б параметр ф, определяемый из соотношений разностей свободной энергии промежуточных, псреходнык н свернутых состояний амннокислотных последовательностей нативного и мутангного белков: ДДО! „ДДО* 'Р! =ДДО,"Ч"=ДДО,.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
