Кокряков - Биология антибиотиков животного происхождения - 1999 (947290), страница 3
Текст из файла (страница 3)
При этом первый цистеин образует Б — Б-смзь с последним цистенном ('1 — 6 Б — Б-смзь), второй — с пятым (2 — 5 Б — Б-смзь) и третий — с четвертым (3 — 4 Б — Б-смзь). Благодаря тому что первый цистеин вступает в образование дисульфидной смзи с шестым цистеином (1 — б Б — Б смзь), молекула дефенсина приобретает циклическую структуру.
Такая особенность нх строения подтверждена крисгаллографическнм (Бсап()е1с( ес а1., 1988; НИ! ес а1., 1991) и ЯМР-спектроскопическим (ВасЬ ес аЬ, 1987; Рагсй ес а1., 1988) исследованиями. В дополнение к этому выявлено пространственное разделение в свернутой глобуле остатков аминокислот, несущих боковые положительно заряженные и гидрофобные группы, что дает основание характеризоватьмолекулу как амфипатическую. Подобнмамфипатическм(амфифильнм) структура дефенсинов делает их активиьсми мембрано- Прпчасть леэенсина анчачаь\ятт — — — -ОООРРОЮЕООптатттнаие аьнапнаппв — — — -ООООтааопьптвтткспэ Йьгатнупйчь — — -ООООР-Оапспьуьньтпее етьсааапетаа — "" — атьатаапт Ратю/аьанпа Отьсааппа-хе †††ООаааптвоаоьат езьаааапв-ат — — — таксасепнспьаьагапнп атьааапптьсакатеиФОЕОапанпспгатзтаапй эеьтаиан †††-аптнннповапнтатсвгнавэ пашнтоа †††-атктаасесекосатачагппта Сигнальный пептил натьаььаат ььта1 Оаса натьаььааь ьштьсаса наты ььаат ььааьоаоа натиаьаатььтаьоаса наттаььаатььуаьптал няттат лат ьшю Отса натьттьтатььтаьпма натттьтаасьььтьнаса нккьтььгаьтььстстаа ю-т нт-5 нт-за ннт-с ннт-4 но-з нп-ь ОРСР-1 сатт-ь Зрелый Соснавной) пептил ттсасаааьсьеванаапгсатнпатнеьссаа ттстсасгьспапеааэпасттнюГВнтьссаа Отсасааагсензаатаатсвтнаиттассваа астсаттастапеайтэтсттсяаьнагсе тсасаьчгсаатвьатснсьтпптагттсстятп тстсатпасатаэзьаптсатапэьтаьпса теней-Азехатэтзтптсттнптинягссь аастсттатсагетааьптсттонатттгсс ьапьтстеазапснпаеаинптсэкпнььттьсса Прочасть а аль еаьптнап тзтьетьпиО~О вьатннтпваннн аваьпчзпатапн ьзаьатааасааа азаьааьпвтаат втаьэпапаеап 1 Отзьсе-эа нт-т нт-з нт-за ннт-т нне-4 нп-з нп-с Отст- Сатт- 9$ 95 93 94 97 94 ьоа 93 93 Рис.
3. Первичные структуры предшественников дефепеииоэ (препропефенеспш). тронными соединениями, способными не только к взаимодействию с фасфолипндами за счет электростатических свойств своей молекулы, но и внедрению в липидный бислой благодаря гндрофобньсм взаимодействиям (Бе1эсес( ес а1., 1993). Дефенсины нейтрофильных гранулоцитов (нейтрофнлов) человека были выделены, очищены и охарактеризованы по структурным н антнмикробным свойствам в 1985 г. (Оапг ес а1., 1985; Бе1ыеб ес а1., 1985Ь).
Общий план их строения сходен с таковым дефенсинов кролика (рис. 2), для которого характерно консервативное расположение шести остатков цистеина, двух — глицина, двух — аргинина и глутаминовой кислоты. Однако основные фракции дефенсинов человека (НХР-1, НХР-2, НХР-3) являются менее катионнымн (только 4 остатка аргннина) н более гидрофобными (5 остатков ароматических аминохислот, включая триптофан) молекулами по сравнению с гомологичными пеппщами из других видовых источников. Первичная структура дефенсинов человека и кролика была подтверждена в молекулярно-генетических исследованиях по клонированию их генов и изучению закономерностей их экспрессии в клетках (РаЬег ес а1., 1988; М(ОЬае1эоп ес а1., 1992). Дефенсины человека синтезируются в промиелоцитах костного мозга в форме молекулы-предшественницы, состоящей из 94 — 100 аминокислот (рис.3). В ходе 6 — 24-часового процессинга препродефенсина НХР-1 происходит последовательное отщепление от его Х-концевой части сначала гидрофобного сипсального пептида (МКТЬА1ЬАА1ЬЬЧАЬс,(Ас сА), затем в 2 этапа анионного профрагмента (ЕРЬЯАКАОЕЧАААРЕЯ1АА01- РЕЧЧЧБЬА тЧ)3ЕБЬАРКНРОБККХМ) с образованием конечной, функционально активной молекулы дефенсина: АСУСК1РАС1АОЕККУОТС1УЯОКЬСЧАРСС (Часоге, Оапз, 1992).
По мнению авторов, биологический смысл установленной последовательности постгрансляционного процессинга молекулы препродефенсина заключается в сз предупреждении аутотоксического действия дефенсинов до момента их упаковки в азурофильные гранулы в аппарате Гольдин. В настоящее время расшифрованы первичные структуры дефенсинов из нейтрофилов морской свишси (Бе1Ыед, Нагелй, 1987; УашазЬ1- Са, Байо, 1989), крысы (ЕВепЬапег ес а1., 1989) и хомячка (Ма1с ег а1., 1996), молекулы которых построены по единому структурному принципу, что позволяет отнести все рассмотренные полипептнды к одному гомологическому классу веществ (см.
рис. 2). Па-видимому, к этому семейству дефенсинов можно отнести и пептид из кожных покровов морской миноги Регготугои тапти (принадлежащей к классу круглоротых (Сус1оаГошаГа), подтипу позвоночных (ЧегзеЬга1а), типу хордовых (СЬогба1а)), который был выделен и секвенирован в 1996 г. (Соп1ол, Боя ег, 1996), Яервичная структура пептида включает 6 остатков цистеина, образующих 3 внугрнмолекулярных дисульфидных мостика, и блок из 3 аргинильных остатков: СРСОККЕССЧЕО(.ХЧУССР.
Эта молекула имеет черты структурного сходства с дефенсинами кролика ЫР-За и крысы ВГЫР-1. В нейтрофилах человека дефенсины составляют 5 — 7% клеточного белка (Оапг, 1987), кролика — до 18% (Хеуа, Брйхпайе1, 1968). Этн полипептиды локализованы преимущественно в азурофильных гранулах нейтрофнлов человека (В)се е~ а1., 1987) и кролика (Уеуа, Брйхпа8е1, 1971), хотя в следовых количествах представлены и в специфических. Необходимо отметить, что нейтрофнльные гранулоциты являются не единственными клетками организма человека и млекопитающих, содержащими дефенсины.
Еще в начале 80-х годов два компонента кроличьих дефенсинов ЫР-1 н ХР-2 были выявлены и в альвеолярных макрофагах — МСР-1 и МСР-2 соответственно (Бе1агес$ е~ а1., 1983). Позднее была выявлена мРНК дефенсинов (Опе11еце е1 а1., 1989а) и расшифрована первичная структура этих полнпептидав из клеток Панета, локализованных в покровном эпителии слизистой тонкого кишечника мышей (Е)зепЬапег е~ а1., 1992; Бе1эГес$ ег а1., 1992а).
Эти дефенсины получили в литературе наименование криптдинов (Е)зепЬаиег е1 а1., 1992), поскольку они локализованы в клетках кишечных крипт. Структура 6 иитестинальных дефенсинов мыши приведена на рис. 2. Есть доказательства присутствия дефенсинов (Н)3-5 и НВ-6) в клетках эпителия тонкой кишхи человека (успев, Вечшз, 1992). Клеточно-тканевая топо~рафия дефенсинов однозначно свидетельствует в пользу их участия в качестве универсальных антимикробных агентов в фор)иированни неспецифической резистентности организма к инфекции.
В условиях (п лйго продемонстрированы бактерицидная (Кокряков и др., 1973, 1977; Анатолий и др., 1977; Ашмарин и др., 1977", Ееуа, БРцхпайе1, 1963, 1966а; УеУа е[ а1., 1966; Бе1зЫ ег а1., 1984), микоцидная (Бейа1 ег а1., 1985) и вирусоцидная (1 еЬгег ег а1., 1985; 0аЬег ег а1., 1986) активности дефенсинов, что позволяет говорить об этой группе полипептидов как об антибиотиках животного происхождения с широким спектром антимикробного действия (Кокряков, 1988; Кокряков и др., 1997; Брцхпа8е1, 1984; Оапх ег а1., 1985; ЬеЬхег е1 а1., 1991а, 1991Ь, 1993). В специальном иммуногистологическом исследовании была доказана важная роль дефенсинов в инактивации возбудителя экспериментального сифилиса у кроликов (Вогепаге)п ег а1., 1991а, 1991Ь). Обосновывая функциональную значимость дефенсинов в обеспечении резистентности к инфекции, оригинальный подход использовали американские исследователи (Сорго е~ а1., 1994).
С помощью приемов генной инженерии онн встроили в геном макрофагов мыши ген дефенсина человека (НЫР-1), экспрессия которого в трансдуцированной клетке была подтверждена определением пептндных молекул нммуноцитохимическим и иммуноферментным методами. Далее авторы оценивали способность исходных и трансдуцированных махрофагов мыши подавлять размножение фагоцитированных дрожжевых клеток грибка Нигор!аюиа сарги1агилз. Ими было установлено, что только в макрофагах, продуцнрующих внутриклеточно дефенсин человека НХР-1, наблюдается снижение роста и размножения дрожжевых клеток.
Интересно отметить, что этот эффект проявляется при концентрациях дефенсина на 4 порядка меньших, нежели имеющих место в зрелых нейтрофилах человека (-50 мкг/107) и альвеолярных макрофагах кролика (6.5 — 20 мкг/107). В морфологических исследованиях, проводимых под руководством профессора В.Е.Пигаревского, неоднократно оценивалась роль дефенсинов как антимикробных агентов нейтрофилов при фагоцитозе н воспалении (Пигаревский, 1975, 1983, 1988; Данилова, 1988; Мазинг, 1988, 1991). В ходе этих исследований был разработан цитохимнческий тест полуколнчественного определения дефенсинов и структурно-родственных им пептидов в нейтрофнльных гранулоцитах человека и экспериментальных животных, который получил название лизосомально-катионного теста (Пигаревский, 1975). Тест нашел широкое клиническое применение для оценки состояния внутриклеточной микробоцндной активности нейтрофилов при различных формах инфекционной патологии.
Накопленные в настоящее время экспериментальные данные дают основание для следующих представлений о механизмах антибиотического действия дефенсинов. Выявлено несколько общих закономерностей в характере действия дефенсинов на Бгарйу!ососсиг аигеиг (1Ча)гоп, О1абз1опе, 1976; '1ч'акоп, 1978), Егсйег1сЫа сой (ЬеЬгег ег а1., 1989) и СагнИа а!Ь)санг ().еЬгег е1 а1., 1988Ь). Положительный заряд молекул дефенсинов определяет их высокое сродство к отрицательно заряженным компонентам (тейхоевые кислоты, липаполисахариды, кислые фосфолнпнды) клеточной оболочхи микроорганизмов. Благодаря электростатическому взаимодействию происходит адсорбция полипептидов на поверхности микробных клеток.
В пользу ведущей роли электростатических сил на первом этапе этого процесса свидетельствуют данные об ослаблении или даже отмене антимикробного действия дефенсинов в присутствии полианионов (ДНК, РНК, поли- фосфаты, гепарин, липополисахариды) нли повышении ионной силы 15 среды выше значения 0.2. Все эти факторы в той нли иной степени подавляют сорбцию пептидов на поверхности клеток-мишеней. В этом отношении поведение дефенсинов сходно с таковым, описанным для ядерных оснбвных белков, — гистонов и протаминов (Ждая-Пушкина, 1973).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
